SIALC研究蛋白质相互作用原理

SILACSILAC研究蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理o2 2：SILACSILAC研究蛋白质相互作用原理研究蛋白质相互作用原理o3 3：SILACSILAC研究蛋白质相互作用文献研究蛋白质相互作用文献 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理o1.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学的原理定量蛋白质组学的原理o1.21.2：SILACSILAC技术流程技术流程 1.2.11.2.1：培养基准备：培养基准备 1.2.21.2.2：细胞标记与测试：细胞标记与测试 1.2.3:1.2.3:实验处理实验处理 1.2.31.2.3：蛋白质分离与质谱分析：蛋白质分离与质谱分析 1.2.41.2.4：结果形式：结果形式 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”；2、细胞处理，如药物处理；3、细胞裂解、提取蛋白质；4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色；5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。1.11.1：SILACSILAC定量蛋白质组学原理定量蛋白质组学原理1.2.11.2.1：培养基准备：培养基准备材料：材料：（1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基，Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培养基。（2）：透析FBS。（3）：稳定同位素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine(15N2,D9),L-Lysine(4,4,5,5-D4),L-Arginine(13C6),L-Arginine(13C6,15N4),L-Arginine(13C6,15N4)。培养基制备：培养基制备：取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重”型培养基。辉骏生物：辉骏生物：http:/ 蛋白质后，等量混合，SDS-PAGE分离，LC-MS/MS检测。辉骏生物：辉骏生物：http:/ 7天后，同一肽段被天后，同一肽段被“重重”型肽段取代型肽段取代 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后，可以进行细胞处理，如药物处理，病毒处理等。1.2.31.2.3：蛋白质分离与质谱分析：蛋白质分离与质谱分析o（1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量混合，SDS-PAGE分离，染色。o（2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。o（3）：LC-MS/MS（仪器：LTQ Orbitrap XL)分析，数据检索。辉骏生物：辉骏生物：http:/ LC-MS/MS分析结果，将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果将会已EXCEL表格呈现。肽段质谱峰图及表达量：2:SILAC2:SILAC研究蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用o2.12.1：SILACSILAC研究蛋白相互作用原理研究蛋白相互作用原理o2.2:SILAC2.2:SILAC研究蛋白质相互作用特点研究蛋白质相互作用特点o2.32.3：SILACSILAC研究蛋白质相互作用方法分类研究蛋白质相互作用方法分类 2.3.12.3.1：Pull-downPull-down法法 2.3.2:Tag-2.3.2:Tag-CoIPCoIP法法 2.3.32.3.3：Bait-Bait-CoIPCoIP法法 2.3.42.3.4：RNAi-Bait-CoIPRNAi-Bait-CoIP 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 辉骏生物：辉骏生物：http:/ down和CoIP法相比，其方法的灵敏度更高、特异性更强.其原理是通过质谱鉴定和分析蛋白质相对量来判断是否是特异性结合，实验组相对于对照组某个蛋白质量的差异达到统计学的差异时，就判定这个蛋白质与目的蛋白质有相互作用。2.22.2：SILACSILAC研究蛋白质相互作用特点研究蛋白质相互作用特点 技术优势目前寻找蛋白质相互作用最先进的方法，与传统CoIP或Pull down相比，改技术具有以下特点：（1）特异性强，假阳性率低；（2）高通量，能同时鉴定出成百甚至上千个蛋白质，能最大限度的寻找到与目的蛋白质相互作用的蛋白质；（3）灵敏度高，液相与质谱连用，肽段分离与质谱鉴定连用，灵敏度比普通质谱高。辉骏生物：辉骏生物：http:/ SILAC2.3 SILAC研究蛋白质相互作用方法分类研究蛋白质相互作用方法分类o2.3.12.3.1：Pull-downPull-down法法o2.3.2:Tag-2.3.2:Tag-CoIPCoIP法法o2.3.32.3.3：Bait-Bait-CoIPCoIP法法o2.3.42.3.4：RNAi-Bait-CoIPRNAi-Bait-CoIPo2.3.52.3.5：上述四种方法比较：上述四种方法比较 辉骏生物：辉骏生物：http:/ Pull down 2.3.1 Pull down 法法原理：原理：（1）:体外表达（原核表达，真核表达等)，纯化出目的蛋白质(tag-bait)及目的蛋白质的对照蛋白（如tag,tag-control protein等).（2）:用tag-bait与标记上“重”型细胞的蛋白质pull down,同时用tag-control与“轻”型细胞蛋白质pull down。（3）:等量混合两次pull down的蛋白质进行LC-MS/MS分析.（4）：交差pull down,用tag-bait与“轻”型细胞蛋白质pull down,tag-control与“重”型细胞蛋白质pull down.Methods.2011 Aug;54(4):387-95.Epub 2011 Mar 52.3.2 Tag-CoIP2.3.2 Tag-CoIP法法原理：原理：（1）：用“重”稳定同位素氨基酸标记细胞后，转染代有标签的目的蛋白质（如GFP-bait,已可用其他标签，如flag,his,biotin等)质粒进入“重”型细胞。（2）：提取“重”型和“轻”型细胞的蛋白质（总蛋白质，核蛋白，膜蛋白质等），等量混合“重”型蛋白和“轻”型蛋白质。（3）：用tag标签的抗体进行CoIP,沉淀下来的蛋白质SDS-PAGE分离后，LC-MS/MS分析。2.3.3 2.3.3 常规常规CoIPCoIP法法原理：原理：（1）：“重”型稳定同位素氨基酸标记细胞后，分别提取“轻”型细胞和“重”型细胞的蛋白质。（2）：“重“型细胞蛋白质用目的蛋白质抗体进行CoIP，”轻“型细胞蛋白质用对照抗体进行CoIP。（3）：等量混合步骤2重CoIP下来的蛋白质或者等量混合CoIP后的Beads,SDS-PAGE分离后，LC-MS/MS分析。原理：原理：（1）将细胞用“重”型同位素氨基酸标记，“轻”型细胞用目的目的蛋白质的siRNA降低目的蛋白质的表达。（2）等量混合“重”型和“轻”型细胞的蛋白质，用目的蛋白质的抗体进行CoIP。（3）CoIP后的蛋白质进行LC-MS/MS分析。2.3.4 RNAi-CoIP2.3.4 RNAi-CoIP2.3.42.3.4：四种方法比较：四种方法比较是否需要抗体操作误差目的基因表达水平复合物形成方式 Pull down 法否每管单独进行pull down误差较大正常体外孵育形成Tag-CoIP法是（但tag抗体几乎都有）同一管里进行CoIP,误差较小过表达，可能会产生其他效用体内形成常规CoIP法是每管单独进行pull down误差较大正常体内形成RNAi-CoIP法是同一管里进行CoIP,误差较小表达下降，可能会产生其他效应体内形成 辉骏生物：辉骏生物：http:/