蛋白质的共价结构课件

第二节第二节 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构蛋白质蛋白质(protein)(protein)是由氨基酸为单位是由氨基酸为单位组成的一类重要的生物大分子，是组成的一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。生命的物质基础。蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成蛋蛋白白质质分分子子中中主主要要的的元元素素组组成成是是：C C、H H、O O、N N、S S等等。其其中中N N元元素素的的含含量量相相对对稳稳定定，约约为为16%16%，故故每每克克氮相当于氮相当于6.256.25克克蛋白质。蛋白质。v蛋蛋白白质质含含量量（克克%）=每每克克生生物物样样品品中中含氮的克数含氮的克数 6.256.25 （凯氏定氮法）蛋白质的分类蛋白质的分类1.蛋白质形状蛋白质形状球状蛋白球状蛋白纤维状蛋白纤维状蛋白蛋白质的分类蛋白质的分类根据分子根据分子形状形状分类分类球状蛋白质球状蛋白质纤维状蛋白质纤维状蛋白质缀合缀合蛋白质蛋白质根据组根据组成分类成分类简单简单蛋白质蛋白质溶解度分类溶解度分类营养价值分类营养价值分类膜蛋白膜蛋白2.分子组成分子组成 简单蛋白（按溶解度）结合蛋白（按辅基）清蛋白球蛋白谷蛋白醇溶蛋白精蛋白组蛋白硬蛋白核蛋白糖蛋白与蛋白聚糖脂蛋白色蛋白磷蛋白简单蛋白质分类简单蛋白质分类缀合蛋白质分类缀合蛋白质分类依据蛋白质的外形分类依据蛋白质的外形分类 球状蛋白质：球状蛋白质：globular proteinglobular protein外形接近球形或椭圆形，外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：纤维状蛋白质：fibrous proteinfibrous protein分子类似纤维或细棒。它分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。膜蛋白：膜蛋白：与细胞的膜系统结合，疏水氨基酸在分子外部，与细胞的膜系统结合，疏水氨基酸在分子外部，不溶于水但能溶于去污剂溶液。不溶于水但能溶于去污剂溶液。根据蛋白质的溶解度分类根据蛋白质的溶解度分类 1.1.清蛋白（白蛋白）清蛋白（白蛋白）易溶于水、中性盐、稀酸、稀碱，被易溶于水、中性盐、稀酸、稀碱，被饱和硫酸铵沉淀。甘氨酸含量较少。饱和硫酸铵沉淀。甘氨酸含量较少。2.2.球蛋白球蛋白 可被半饱和硫酸铵沉淀。可被半饱和硫酸铵沉淀。（1 1）拟球蛋白）拟球蛋白 （假球蛋白）溶于水。（假球蛋白）溶于水。（2 2）优球蛋白）优球蛋白 不溶于水，溶于稀盐不溶于水，溶于稀盐 例：肌球蛋白，肌球蛋白，血清球蛋白等。血清球蛋白等。3.3.组蛋白组蛋白 组成染色体的蛋白质，含组成染色体的蛋白质，含ArgArg和和 LysLys较多。呈碱较多。呈碱性。例：性。例：H H1 1，H H2a2a，H H2b2b，H H3 3和和H H4 4等根据蛋白质的营养价值分类根据蛋白质的营养价值分类1.1.完全蛋白质完全蛋白质 含有人体必需的各种氨基酸。含有人体必需的各种氨基酸。2.2.不完全蛋白质不完全蛋白质 缺乏人体必需的某种氨基酸。缺乏人体必需的某种氨基酸。（二）蛋白质的形状与大小（二）蛋白质的形状与大小 1.1.形状形状 2.2.大小大小球状蛋白球状蛋白纤维状蛋白纤维状蛋白膜蛋白膜蛋白蛋白质分子量为蛋白质分子量为6000到到1106 更大一些。最小的更大一些。最小的分子量为分子量为5700。多肽中。多肽中一个氨基酸残基的分子一个氨基酸残基的分子量为量为110。蛋蛋白白质质结结构构的的主主要要层层次次一级结构一级结构四级结构四级结构二级结构二级结构三级结构三级结构primary structureprimary structuresecondary structuresecondary structureTertiary structureTertiary structurequariernaryquariernary structure structure超二级结构超二级结构结构域结构域 supersecondarysupersecondary structure structureStructure Structure domandoman蛋蛋白白质质结结构构的的主主要要层层次次一级结构一级结构四级结构四级结构二级结构二级结构三级结构三级结构primary structureprimary structuresecondary structuresecondary structureTertiary structureTertiary structurequariernaryquariernary structure structure超二级结构超二级结构结构域结构域 supersecondarysupersecondary structure structureStructure Structure domandoman -折叠片折叠片 -螺旋体螺旋体 松散肽段松散肽段亚基亚基三级结构三级结构四级结构四级结构蛋蛋白白质质分分子子的的构构象象示示意意图图Levels of structure in proteins蛋白质的主要功能：蛋白质的主要功能：催化催化调节调节转运转运储存储存运动运动结构成分结构成分支架作用支架作用防御与进攻防御与进攻异常功能异常功能（四）蛋白质功能的多样性（四）蛋白质功能的多样性 1、催化功能、催化功能 酶酶 （淀粉酶）（淀粉酶）2、调节功能、调节功能 激素（胰岛素）激素（胰岛素）3、运动功能、运动功能 肌球蛋白肌球蛋白 4、运输功能、运输功能 血红蛋白血红蛋白 5、防御功能、防御功能 免疫球蛋白免疫球蛋白 6、储存功能、储存功能 酪蛋白酪蛋白 7、结构成分、结构成分 胶原蛋白胶原蛋白 8、支架作用、支架作用 微管蛋白微管蛋白 9、异常功能、异常功能 甜蛋白（应乐果蛋白）甜蛋白（应乐果蛋白）蛋白质（蛋白质（proteinprotein）是生活细胞内含量最是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与生物大分子，并参与了几乎所有的生命活了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学功能始终是生命科学最基本的命题。最基本的命题。蛋白质的结构蛋白质的结构 蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）。在结构白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种结构层次：一级结构，二级结构，三级结蛋白质有四种结构层次：一级结构，二级结构，三级结构和四级结构（不总是有）。构和四级结构（不总是有）。蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核中的核苷酸序列决定的。苷酸序列决定的。维系蛋白质一级结构的主要化学键为维系蛋白质一级结构的主要化学键为肽键肽键。蛋白质一级结构与蛋白质共价结构 肽键 二硫键肽肽(peptide)(peptide)肽键与肽链：肽键与肽链：蛋蛋白白质质是是由由若若干干氨氨基基酸酸的的氨氨基基与与羧羧基基经经脱脱水水缩缩合合而而连连接接起起来来形形成成的的长长链链化化合合物物。一一个个氨氨基基酸酸分分子子的的-羧羧基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸分分子子的的-氨氨基基在在适适当当的的条条件件下下经经脱脱水水缩合即生成缩合即生成肽肽。两两氨氨基基酸酸单单位位之之间间的的酰酰胺胺键键，称称为为肽肽键键。多多肽链中的氨基酸单位称为肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基氨基酸残基。多多肽肽链链具具有有方方向向性性，头头端端为为氨氨基基端端（N N端端），尾端为尾端为羧基端羧基端（C C端）。端）。凡凡氨氨基基酸酸残残基基数数目目在在5050个个以以上上，且且具具有有特特定定空空间间结结构构的的肽肽称称蛋蛋白白质质；凡凡氨氨基基酸酸残残基基数数目目在在5050个以下，个以下，且无特定空间结构?者称多肽。者称多肽。Ser-Val-Tyr-Asp-Gln（一）肽和肽键的结构（一）肽和肽键的结构肽平面肽平面肽键肽键l肽肽键键的的特特点点是是氮氮原原子子上上的的孤孤对对电电子子与与羰羰基基具具有有明显的共轭作用。明显的共轭作用。l组成肽键的原子处于同一平面。组成肽键的原子处于同一平面。0.127nm0.127nm键长键长=0.132nm=0.132nm 0.148nm0.148nml肽键中的肽键中的C-NC-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。键具有部分双键性质，不能自由旋转。l在大多数情况下，以反式结构存在在大多数情况下，以反式结构存在。2.肽键（反式）肽键（反式）3.肽单位肽单位肽的结构肽的结构4.肽平面肽平面肽键具有一定程度的双键性质，参与肽键的六个原子C、H、O、N、C1、C2不能自由转动，位于同一平面，此平面就是肽肽平面平面。5.肽的二面角肽的二面角 二面角二面角 两两相相邻邻酰酰胺胺平平面面之之间间，能能以以共共同同的的C C为为定定点点而而旋旋转转，绕绕C C-N-N键键旋旋转转的的角角度度称称角角，绕绕C-C-C C键键旋旋转转的的角角度度称称角角。和和称称作作二二面面角角，亦称构象角。亦称构象角。肽基的肽基的C、O和和N原子间的共振相互作用原子间的共振相互作用共振产生的重要结果：共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面形成酰胺平面 产生键的平均化产生键的平均化 肽键呈反式构型肽键呈反式构型sp2sp2sp2sp3共振杂化体共振杂化体（二）肽的物理化学性质（二）肽的物理化学性质 1.物理性质物理性质 2.化学性质化学性质离子晶体，熔点很高，在离子晶体，熔点很高，在PH 0PH 01414范围内酰胺氢不解离，范围内酰胺氢不解离，酸碱性质主要决定于酸碱性质主要决定于 -NH-NH2 2和和-COOH-COOH以及以及R R基团。基团。和氨基酸一样，游离的和氨基酸一样，游离的-NH-NH2 2和和-COOH-COOH以以R R基团可以发生和基团可以发生和氨基酸中相应的基团的反应。特殊的反应为双缩脲反应。氨基酸中相应的基团的反应。特殊的反应为双缩脲反应。生物活性肽：生物活性肽：生生物物体体内内具具有有一一定定生生物物学学活活性性的的肽肽类类物物质质称称生生物物活活性性肽肽。重重要要的的有有谷谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。胱甘肽、神经肽、肽类激素等。1.1.谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSHGSH）：）：全称为全称为-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。其巯基可氧化、还原，故有还原型（可氧化、还原，故有还原型（GSHGSH）与氧化）与氧化型（型（GSSGGSSG）两种存在形式。）两种存在形式。谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione)glutathione)谷谷胱胱甘甘肽肽在在体体内内参参与与氧氧化化还还原原过过程程，作作为为某某些些氧氧化化还还原原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。谷胱甘肽的生理功用：谷胱甘肽的生理功用：解解毒毒作作用用：与与毒毒物物或或药药物物结结合合，消消除除其其毒毒性作用；性作用；参参与与氧氧化化还还原原反反应应：作作为为重重要要的的还还原原剂剂，参与体内多种氧化还原反应；参与体内多种氧化还原反应；保保护护巯巯基基酶酶的的活活性性：使使巯巯基基酶酶的的活活性性基基团团-SH-SH维持还原状态；维持还原状态；维维持持红红细细胞胞膜膜结结构构的的稳稳定定：消消除除氧氧化化剂剂对对红细胞膜结构的破坏作用。红细胞膜结构的破坏作用。2.2.多肽类激素：多肽类激素：种类较多，生理功能各种类较多，生理功能各异。主要见于下丘脑及异。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。垂体分泌的激素。鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱促甲状腺素释放因子促甲状腺素释放因子（TRH）胰胰岛岛素素（InsulinInsulin）由由5151个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，分分为为A A、B B两两条条链链。A A链链2121个个氨氨基基酸酸残残基基，B B链链3030个个氨氨基基酸酸残残基基。A A、B B两两条条链链之之间间通通过过两两个个二二硫硫键键联结在一起，联结在一起，A A链另有链另有一个链内二硫键。一个链内二硫键。蛋白质一级结构的蛋白质一级结构的测定测定测定蛋白质的一级结构的主要意义：测定蛋白质的一级结构的主要意义：蛋蛋白白质质氨氨基基酸酸顺顺序序的的测测定定是是蛋蛋白白质质化化学学研研究究的的基基础础。自自从从19531953年年F.SangerF.Sanger测测定定了了胰胰岛岛素素的的一一级级结结构构以以来来，现现在在已已经经有有上上千千种种不不同同蛋蛋白白质质的的一级结构被测定。一级结构被测定。主要意义：主要意义：一级结构是研究高级结构的基础。一级结构是研究高级结构的基础。可可以以从从分分子子水水平平阐阐明明蛋蛋白白质质的的结结构构与与功功能能的的关系。关系。可以为生物进化理论提供依据可以为生物进化理论提供依据 可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。l1 1，样品必需纯（样品必需纯（97%97%以上）；以上）；（分离纯化蛋分离纯化蛋白质，得到一定量的蛋白质纯品。）白质，得到一定量的蛋白质纯品。）l2 2，知道蛋白质的分子量；，知道蛋白质的分子量；l3 3，知道蛋白质由几个亚基组成；，知道蛋白质由几个亚基组成；l4 4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。分子量计算每种氨基酸的个数。（取一定量取一定量的样品进行完全水解，再用氨基酸自动分析仪，测定蛋白质的的样品进行完全水解，再用氨基酸自动分析仪，测定蛋白质的氨基酸组成。）氨基酸组成。）l5 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量含量。测定蛋白质的一级结构的要求测定蛋白质的一级结构的要求蛋白质的氨基酸组成分析蛋白质的氨基酸组成分析三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定 （一）蛋白质测序的策略（一）蛋白质测序的策略 （二）（二）N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸的鉴定末端氨基酸的鉴定 （三）二硫桥的断裂（三）二硫桥的断裂 （四）氨基酸组成的分析（四）氨基酸组成的分析 （五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 （六）肽段氨基酸序列的测定（六）肽段氨基酸序列的测定 （七）肽段在多肽链中次序的决定（七）肽段在多肽链中次序的决定 （八）二硫桥位置的确定（八）二硫桥位置的确定 （九）蛋白质测序举例（九）蛋白质测序举例 （十）蛋白质序列数据库（十）蛋白质序列数据库（一）蛋白质测序的策略（片断重叠法）（一）蛋白质测序的策略（片断重叠法）1.1.测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 2.2.拆分蛋白质分子的多肽链拆分蛋白质分子的多肽链 3.3.断开多肽链内的二硫桥断开多肽链内的二硫桥 4.4.分析每一条多肽链的氨基酸组成分析每一条多肽链的氨基酸组成 5.5.鉴定多肽链鉴定多肽链N-N-末端和末端和C-C-末端残基末端残基 6.6.裂解多肽链成较小的片段裂解多肽链成较小的片段 7.7.测定各肽段的氨基酸序列测定各肽段的氨基酸序列 8.8.重建完整多肽链的一级结构重建完整多肽链的一级结构 9.9.确定半胱氨酸残基间形成的确定半胱氨酸残基间形成的S-SS-S交联桥交联桥测定步骤测定步骤 蛋蛋白白质质多多肽肽链链的的氨氨基基酸酸顺顺序序分分析析，即即蛋蛋白白质质一一级结构的测定，主要包括以下几个步骤：级结构的测定，主要包括以下几个步骤：1.1.测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。2.2.多肽链的拆分多肽链的拆分 几几条条多多肽肽链链借借助助非非共共价价键键连连接接在在一一起起，称称为为寡寡聚聚蛋蛋白白质质，如如，血血红红蛋蛋白白为为四四聚聚体体，烯烯醇醇化化酶酶为为二二聚聚体体；可可用用8mol/L8mol/L尿尿素素或或6 6mol/Lmol/L盐盐酸酸胍胍处处理，即可分开多肽链理，即可分开多肽链(亚基亚基).).3.3.二硫键的断裂二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在用几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在用8mol/L8mol/L尿尿素或素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇处理，巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。巯基，以防止它重新被氧化。s ss sHcoooHHcoooHSOSO3 3H HSOSO3 3H H(过甲酸）过甲酸）5.5.分析分析多肽链的多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端l多肽链端基氨基酸分为两类：多肽链端基氨基酸分为两类：N-N-端氨基端氨基酸和酸和C-C-端氨基酸。端氨基酸。l在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。4.4.测定每条多肽链的氨基酸组成测定每条多肽链的氨基酸组成 水解水解 氨基酸分析仪氨基酸分析仪（二）（二）N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸的鉴定末端氨基酸的鉴定N-N-端端 SangerSanger法（法（二硝基氟苯反应二硝基氟苯反应）DNSDNS法法（丹磺酰氯反应丹磺酰氯反应）EdmanEdman法（法（苯异硫氰酸脂反应苯异硫氰酸脂反应）氨肽酶法氨肽酶法 C-C-端端 肼解法肼解法 还原法还原法 羧肽酶法羧肽酶法Sanger因创造了蛋白质一级结构和因创造了蛋白质一级结构和DNA序序列的测定方法两次获诺贝尔奖。列的测定方法两次获诺贝尔奖。DNFB（2，4-二硝基氟苯，二硝基氟苯，Sanger 试剂）。试剂）。DNFB只与蛋白质的游离末端氨基酸的氨只与蛋白质的游离末端氨基酸的氨基反映，脱去一分子基反映，脱去一分子HF，形成，形成DNP多肽多肽或或DNP蛋白质。由于蛋白质。由于DNFB与氨基形成的与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定，因此键对酸水解远比肽键稳定，因此DNP-多多肽经酸水解后，只有肽经酸水解后，只有N-末端氨基酸为黄色末端氨基酸为黄色的的DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。其溶于乙酸乙酯。后可用色谱提氨基酸。其溶于乙酸乙酯。后可用色谱提取分离。虽然可能和侧链氨基反应，但产取分离。虽然可能和侧链氨基反应，但产物不溶于乙酸乙酯。物不溶于乙酸乙酯。Frederick SangerCambridgeBorn 1912Nobel price 1958 and 1980Sanger developed methods for sequencing both proteins and nucleic acids,and got the price twice.InsulinDNFBDNFB法分析法分析N-N-端氨基酸残基端氨基酸残基lSangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNPDNP）。）。l在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色DNP-DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的抽提分离。不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法1953，Frederick Sanger has Sequenced the first protein(peptide)l在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-N-端氨端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。氨基酸。l此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到以达到1 1 1010-9-9molmol。丹磺酰氯法丹磺酰氯法EdmanEdman反应反应-苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯在碱性条件下，能够与肽链在碱性条件下，能够与肽链N-N-端的端的游离氨基作用，生成苯氨基硫甲酰衍生物（游离氨基作用，生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTH-PTH-肽）。肽）。在酸性有机溶剂中加热，得到在酸性有机溶剂中加热，得到PTH-PTH-氨基酸氨基酸,其它肽链是完整其它肽链是完整的。的。PTH-PTH-氨基酸经有机溶剂抽提后可以用色谱法进行鉴定。氨基酸经有机溶剂抽提后可以用色谱法进行鉴定。苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC)PITC)法法法法 弱碱弱碱 AAAAPITC+PITC+多肽多肽 蛋白蛋白 AAAAPTCPTC多肽多肽 蛋白蛋白酸性有机溶剂酸性有机溶剂PTH-AA+PTH-AA+少一个少一个AAAA的多肽或蛋白的多肽或蛋白（乙酸乙酯）（乙酸乙酯）l氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-N-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。l根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-N-末端残基顺序。末端残基顺序。l最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为氨酸残基为N-N-末端的肽键速度最大。末端的肽键速度最大。氨肽酶法氨肽酶法肼解法分析肼解法分析C-C-端氨基酸残基端氨基酸残基l此法是多肽链此法是多肽链C-C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，件下加热，C-C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与成不溶于水的物质而与C-C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。肼解法肼解法l羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的知道蛋白质的C-C-末端残基顺序。末端残基顺序。l目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A A和和B B来自胰脏；来自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。l羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末末端残基的肽键。端残基的肽键。羧肽酶法羧肽酶法6.6.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。或肽碎片，并将其分离开来。l 酶解法酶解法:l胰蛋白酶胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶酶，羧肽酶和氨肽酶l 化学法：化学法：可获得较大的肽段可获得较大的肽段l溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。的羧基所形成的肽键。多肽链断裂法：多肽链断裂法：酶解法和化学法酶解法和化学法胰蛋白酶（胰蛋白酶（trypsintrypsin)的裂解作用的裂解作用lTrypsin ：R R1 1=赖氨酸赖氨酸LysLys和精氨酸和精氨酸ArgArg侧链侧链（专一性较强，水解速度快）。（专一性较强，水解速度快）。肽链水解位点水解位点胰胰蛋蛋白白酶酶l或胰凝乳蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：）：R1=R1=苯丙苯丙氨酸氨酸PhePhe,色氨酸色氨酸TrpTrp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu，蛋氨酸蛋氨酸MetMet和组氨酸和组氨酸HisHis水解稍慢。水解稍慢。肽链水解位点水解位点糜糜蛋蛋白白酶酶lPepsin：R1R1和和R2R2R1=R1=苯丙氨酸苯丙氨酸PhePhe,色氨酸色氨酸TrpTrp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu以及其它疏水以及其它疏水性氨基酸水解速度较快性氨基酸水解速度较快。肽链水解位点水解位点胃胃蛋蛋白白酶酶lthermolysin)：R2=R2=苯丙氨酸苯丙氨酸PhePhe,色氨酸色氨酸TrpTrp,酪氨酸酪氨酸Tyr;Tyr;亮氨酸亮氨酸LeuLeu，异亮氨酸异亮氨酸IleuIleu,蛋氨酸蛋氨酸MetMet以及其它疏水性强的氨基以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。酸水解速度较快。肽链水解位点水解位点嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶溴化氰（溴化氰（BrCNBrCN）的裂解作用）的裂解作用它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。7.7.分离肽段分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。测定每个肽段的氨基酸顺序。EdmanEdman （苯异硫氰酸酯法）苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序氨基酸顺序分析法实际上也是一种分析法实际上也是一种N-N-端分析法。此端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。端氨基酸残基逐一进行标记和解离。EdmanEdman降解法测定氨基酸序列降解法测定氨基酸序列异异硫硫氰氰酸酸苯苯酯酯氨基酸自动测序仪氨基酸自动测序仪8.8.确定确定肽段在多肽链中的次序。肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。序。示例示例(十肽的水解十肽的水解)A A法水解得到四个小肽：法水解得到四个小肽：A1 Ala-A1 Ala-PhePhe A2 A2 Gly-Lys-Asn-TyrGly-Lys-Asn-Tyr A3 A3 ArgArg-Tyr-Tyr A4 His-Val A4 His-Val B B法水解得到三个小肽：法水解得到三个小肽：B1 Ala-B1 Ala-Phe-Gly-LysPhe-Gly-Lys B2 B2 Asn-Tyr-ArgAsn-Tyr-Arg B3 Tyr-His-Val B3 Tyr-His-Val9.9.确定原多肽链中确定原多肽链中二硫键的位置。二硫键的位置。l一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，键的多肽链，(切点多，二硫键稳定切点多，二硫键稳定)l再利用双向电泳技术分离出各个肽段，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，成及顺序分析，l然后同其它方法分析的肽段进行比较，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。确定二硫键的位置。lBrownBrown及及HartlayHartlay的对角线电泳技术的对角线电泳技术+-第第二二向向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中图中a a、b b两个斑点是两个斑点是由一个二硫键断裂由一个二硫键断裂产生的肽段产生的肽段+Short polypeptides are sequenced using automated procedures Breaking disulfide bonds in proteins Large Proteins Must Be Sequenced in Smaller Segments Fragmenting proteins prior to sequencing,and placing peptide fragments in their proper order with overlaps.蛋白质一级结构举例蛋白质一级结构举例胰岛素（胰岛素（InsulinInsulin）(由由5151个氨基酸残基个氨基酸残基组成，分为组成，分为A A、B B两条链。两条链。A A链链2121个氨基酸个氨基酸残基，残基，B B链链3030个氨基酸残基。个氨基酸残基。A A、B B两条链两条链之间通过之间通过两个二硫键两个二硫键联结在一起，联结在一起，A A链另链另有有一个链内二硫键一个链内二硫键。分子量分子量5700).5700).同源蛋白质同源蛋白质同源蛋白质：不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，这种相似性称为序列同源（性）。具有明显序列同源的蛋白质也称同源蛋白质。同源蛋白质的氨基酸序列分析揭示，这些蛋白质有着一个共同的进化祖先。细胞色素C的氨基酸序列资料已用来核对各个物种之间的分类学关系以及绘制系统（发生树）或进化树。Current phylogeny tree of life(by Carl Woese)作业：作业：什么叫氨基酸的等电点？什么叫氨基酸的等电点？现有含现有含Asp、Arg、Ala的待测样品，的待测样品，若在若在pH为为6.8的缓冲系统中电泳，按下图的缓冲系统中电泳，按下图标出各氨基酸的名称，并说明之。标出各氨基酸的名称，并说明之。-+试述蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序试述蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序测定的一般步骤。测定的一般步骤。一个七肽，其氨基酸组成是：一个七肽，其氨基酸组成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr、Ser；未经糜蛋白酶处理，与未经糜蛋白酶处理，与DNFB反应，反应，不产生不产生-DNP-氨基酸，经糜蛋白酶处氨基酸，经糜蛋白酶处理后，断裂成两个肽段（理后，断裂成两个肽段（Ala、Tyr、Ser 和和Lys、Pro、Arg、Phe），两肽），两肽分别与分别与DNFB反应，产生反应，产生DNP-Ser和和DNP-Lys；此七肽与胰蛋白酶反应，此七肽与胰蛋白酶反应，生成两个肽段（生成两个肽段（Pro、Arg 和和Lys、Phe、Ala、Tyr、Ser。问此七肽的一。问此七肽的一级结构？级结构？