FISH荧光原位杂交技术

荧光原位杂交实验荧光原位杂交实验 Fluorescence In Situ Hybridization 原位杂交原位杂交(In situ hybridization)1）同位素原位杂交）同位素原位杂交(Isotopic in situ hybridization)70年代年代 2）非同位素原位杂交）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization)80年代中后期年代中后期 （1）免疫酶联）免疫酶联 （2）荧光原位杂交（）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH)*同位素原位杂交的不足之处：同位素原位杂交的不足之处：1）不稳定；）不稳定；2）高背景；）高背景；3）曝光时间长；）曝光时间长；4）结果统计学处理繁琐。）结果统计学处理繁琐。5）同位素的使用和处理）同位素的使用和处理实验的基本原理实验的基本原理:FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy.DNA for probe use is labeled with fluorescent(direct method)or non fluorescent molecules which are then detected by fluorescent antibodies(indirect method).The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome.The chromosomes are then stained using a contrasting color,and the cells are viewed using a fluorescence microscope.*荧光原位杂交的特点：荧光原位杂交的特点：1）快速；）快速；2）信号强；）信号强；3）特异性高；）特异性高；4）多色。）多色。*FISH有上述优点的原因：有上述优点的原因：使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统标记探针的物质：标记探针的物质：（1）生物素）生物素(biotin)/地高辛地高辛(digoxigenin)半抗原报告分子（间接标记）半抗原报告分子（间接标记）（2）荧光物质（直接标记）荧光物质（直接标记）FLUORESCENT labeled FLUORESCENT labeled dUTPdUTP HAPTENE labeled HAPTENE labeled dUTPdUTP AMCA-6-dUTPAMCA-6-dUTPCascadeBlue-4-dUTPCascadeBlue-4-dUTPFluorescein-12-dUTPFluorescein-12-dUTPRhodamine-6-dUTPRhodamine-6-dUTPTexasRed-6-dUTPTexasRed-6-dUTPCy3-6-dUTPCy3-6-dUTPCy5-dUTPCy5-dUTPBiotin(BIO)-11-dUTPBiotin(BIO)-11-dUTPDigoxygenin(DIG)-11-Digoxygenin(DIG)-11-dUTPdUTPDinitrophenylDinitrophenyl(DNP)-(DNP)-11-dUTP11-dUTP 染色体复染的物质染色体复染的物质:Propidium Iodide(PI)（红色）（红色）DAPI（兰色）（兰色）quinacrine（绿色）（绿色）chromomycine A3（绿色）（绿色）染色体染色体“原位抑制原位抑制”杂交（杂交（chromosome in situ suppression,CISS)克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针中加入过量的未标记的竞争性中加入过量的未标记的竞争性DNA(competitor DNA)，如如human Cot-1 DNA，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。*FISH技术的应用技术的应用1）基因（或）基因（或DNA片段）的染色体定位；片段）的染色体定位；2）染色体数目与结构异常的检测；）染色体数目与结构异常的检测；3）间期细胞遗传学（绒毛）间期细胞遗传学（绒毛/羊水羊水/精子精子/卵裂球卵裂球/其它间期细胞研究其它间期细胞研究与诊断）；与诊断）；4）肿瘤遗传学研究）肿瘤遗传学研究*用于用于FISH的探针的探针1）单拷贝探针：）单拷贝探针：（1）种类：）种类：YAC，BAC，Cosmid，Plasmid，cDNA片段片段 （2）应用）应用 （a）定位）定位DNA片段及嵌合体克隆验证；片段及嵌合体克隆验证；（b）确定染色体微小缺失与重复；）确定染色体微小缺失与重复；（c）染色体断裂点分析。）染色体断裂点分析。（d）间期细胞染色体数目异常诊断。）间期细胞染色体数目异常诊断。DNA片段的染色体定位片段的染色体定位FISH检测微小缺失检测微小缺失染色体片段重复染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.121q22.2 BAC克隆在克隆在Down综合征间期细胞中的杂交信号综合征间期细胞中的杂交信号）简单重复序列探针）简单重复序列探针(simple repetitive probes)异染色质着丝粒探针异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)其靶序列为其靶序列为卫星卫星DNA或卫星或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和异多位于染色体的着丝粒和异染色质区域，重复数百次至数千次。染色质区域，重复数百次至数千次。特点：信号强特点：信号强应用：应用：(a)标记染色体识别标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断间期细胞遗传学研究和临床诊断*间期细胞遗传学的意义：间期细胞遗传学的意义：细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相，间期获得中期染色体分裂相，间期FISH为这一时期为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而且快速。遗期传物质的研究提供了可能，而且快速。）染色体涂染探针）染色体涂染探针(chromosome painting probes)整条染色体探针或染色体区带特异性探针整条染色体探针或染色体区带特异性探针探针来源：探针来源：（1）含有人单条染色体的人）含有人单条染色体的人-啮齿类啮齿类(human-rodent)体细胞杂体细胞杂种组织融合的产物；种组织融合的产物；（2）荧光激活的流式细胞仪）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体分离整条染色体DNA，并以载体克隆，并以载体克隆/PCR扩扩增；增；（3）显微切割得到染色体或染色体片段，）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增；扩增；应用（应用（1）染色体数目和结构异常分析；）染色体数目和结构异常分析；（2）不同物种间的同源性比较；）不同物种间的同源性比较；（3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。多色多色FISH（muti-color FISH)多色复合染色体多色复合染色体FISH探针探针(multiplex FISH,M-FISH probes)#两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统，两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统，通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。实验的基本操作步骤及时间安排实验的基本操作步骤及时间安排一淋巴细胞的培养及染色体标本制备一淋巴细胞的培养及染色体标本制备第一天第一天（星期一）（星期一）采血、接种（采血、接种（10:00）第二天第二天（星期二）（星期二）培养培养第三天第三天（星期三）培养（星期三）培养第四天（星期四）上午第四天（星期四）上午7:00 加秋水仙素加秋水仙素,(终浓度终浓度0.2ug/ml）至上午至上午10:00结束培养结束培养制片，不染色，在显微镜下挑选分散良好的标本。将选好的制片，不染色，在显微镜下挑选分散良好的标本。将选好的标本放入标本放入50 烤片烤片。第五天（星期五）第五天（星期五）探针变性：探针变性：75水浴水浴5分钟，立即置于分钟，立即置于0（冰浴中）（冰浴中）5-10分钟。分钟。玻片标本变性：玻片标本变性：1.50温箱中温箱中2小时小时2.标本在标本在70-75，70%甲酰胺甲酰胺/2XSSC中变性中变性2-3分分钟。钟。3.立即脱水，立即脱水，70-90-100%顺序，各顺序，各5分钟。分钟。4.室温干燥室温干燥原位杂交：原位杂交：将变性的将变性的DNA探针探针10ul滴于变性并脱水的滴于变性并脱水的玻片标本上，盖上盖玻片，玻片标本上，盖上盖玻片，Parafilm封片，封片，置于湿盒中置于湿盒中37杂交过夜。（杂交过夜。（15-17hr）第五天实验结束第五天实验结束(第六天，星期六第六天，星期六)洗脱、信号放大和免疫荧光检测洗脱、信号放大和免疫荧光检测1.用刀片将盖片揭起，轻轻移掉。用刀片将盖片揭起，轻轻移掉。2.4550%甲酰胺甲酰胺/2XSSC中洗中洗3次，每次次，每次5分钟。分钟。3.45 1XSSC中洗中洗3次，每次次，每次5分钟。分钟。4.室温下，室温下，2XSSC轻洗一下。轻洗一下。5 加加180ul封闭液封闭液I，以薄膜盖片，以薄膜盖片，37 温育温育20分钟分钟，加入，加入180ul avidin-FITC,37 温育温育45分钟。分钟。6.取出标本，取出标本，45，4XSSC/0.1%Tween20中洗中洗3次，每次次，每次5分钟。分钟。7 加封闭液加封闭液II,37 温育温育20分钟。分钟。8 加加180ul antiavidin于标本上，于标本上，37 45分钟。分钟。9 取出标本，取出标本，45，4XSSC/0.1%Tween20中洗中洗3次，每次次，每次5分钟。分钟。10 加加180ul封闭液封闭液I，37 温育温育 20分钟。分钟。11 加加180ulavidin-FITC，37 温育温育45分钟。分钟。12取出标本，取出标本，45，4XSSC/0.1%Tween20中洗中洗2次，每次次，每次5分钟。再于分钟。再于2XSSC室温轻洗一下。室温轻洗一下。13 将玻片自然干燥，将玻片自然干燥，PI/antifade复染，盖上盖片。复染，盖上盖片。14 镜检、照相。镜检、照相。