植物细胞工程的理论基础

第二章第二章 植物细胞植物细胞工程的理论基础工程的理论基础1.1.细胞分化与细胞全能性细胞分化与细胞全能性2.2.器官发生器官发生3.3.离体培养下的遗传与变异离体培养下的遗传与变异1.1.细胞全能性细胞全能性一一.细胞全能性的一般概念细胞全能性的一般概念二二.细胞分化细胞分化三三.离体培养中细胞的脱分化、再分化离体培养中细胞的脱分化、再分化一一.细胞全能性的一般概念细胞全能性的一般概念一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。称之为细胞的全能性。细胞全能性的绝对性与相对性细胞全能性的绝对性与相对性:不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应良好的培养反应;即使对于植物细胞而言，细胞即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体物个体;动、植物细胞全能性的表现程度存在明动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。显的差异。植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心营养生长中心 形成层形成层 薄壁细胞薄壁细胞 厚壁厚壁细胞细胞(木质化细胞木质化细胞)特化细胞特化细胞(筛管、导管细胞筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织顶端分生组织 居间分生组织居间分生组织 侧生分生组侧生分生组织织 薄壁组织薄壁组织(基本组织基本组织)厚角组织厚角组织 输导输导组织组织 厚壁组织。厚壁组织。二二.离体培养中细胞的脱分化（离体培养中细胞的脱分化（DedifferentiationDedifferentiation）脱分化脱分化外植体外植体愈伤组织或愈伤组织或 体细胞胚体细胞胚 完整植株完整植株脱分化细胞脱分化细胞 不定器官不定器官 直接伸长直接伸长茎尖培养（较大时）茎尖培养（较大时）完整植株完整植株发育发育幼胚培养（较大时）幼胚培养（较大时）完整植株完整植株外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织愈伤组织。愈伤组织的种类愈伤组织的种类1、胚性愈伤组织胚性愈伤组织（Embryoneniccallus）：表面）：表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。性愈伤组织。2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。细胞大。注意：注意：1、并不是所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈、并不是所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。有些植物体的细胞脱分化以后直接形成伤组织。有些植物体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞，进而形成体细胞胚。胚性细胞，进而形成体细胞胚。2、多数愈伤组织内的细胞并不都是未分化的细胞，、多数愈伤组织内的细胞并不都是未分化的细胞，即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定的即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定的差异。差异。三三.细胞分化细胞分化l所谓细胞分化，是指在个体发育进程中所谓细胞分化，是指在个体发育进程中,细胞发生化细胞发生化学组成、形态结构和功能等发生改变的现象。分化程学组成、形态结构和功能等发生改变的现象。分化程度低的细胞其分化能力强度低的细胞其分化能力强,分化程度高的细胞其分化分化程度高的细胞其分化能力弱。能力弱。时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；同的形态结构和功能；空间上的分化空间上的分化：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，：对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。1 1细胞分化与基因组变化细胞分化与基因组变化 细胞分化过程中，可以观察到的最常见的变化是染细胞分化过程中，可以观察到的最常见的变化是染色体的反复复制，而并不进行细胞分裂。核内染色体的色体的反复复制，而并不进行细胞分裂。核内染色体的复制过程可以区分出两种主要类型，一是核内有丝分裂，复制过程可以区分出两种主要类型，一是核内有丝分裂，导致核内多倍体，二是大量复制染色丝，导致形成多线导致核内多倍体，二是大量复制染色丝，导致形成多线染色体。染色体。在植物的分化发育中，另一类基因组的变化是基因在植物的分化发育中，另一类基因组的变化是基因重排。例如，在玉米、金鱼草等植物中，转座子的移动重排。例如，在玉米、金鱼草等植物中，转座子的移动能引起很多发育性状的改变。能引起很多发育性状的改变。2.2.细胞分化与极性建立细胞分化与极性建立 极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是是细胞在很多情况下，细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的标志。极性建立的标志。无论是在活体还是在离体条件下，一般认为，无论是在活体还是在离体条件下，一般认为，极性的建立极性的建立和和维管成分的产生维管成分的产生，是植物细胞分化，是植物细胞分化的基本特征。的基本特征。3.3.细胞分化的过程细胞分化的过程 细胞分化可分为两个阶段：细胞分化可分为两个阶段：决定：是指胚胎细胞在发育过程中发生的不可逆决定：是指胚胎细胞在发育过程中发生的不可逆的特化现象。因此，决定就是细胞发育途径的特化现象。因此，决定就是细胞发育途径的确定，它是细胞分化的早期过程；的确定，它是细胞分化的早期过程；分化细胞特征逐渐表现：在大多数情况下，细胞分化细胞特征逐渐表现：在大多数情况下，细胞从决定到表现特定细胞特征通常需要经过几从决定到表现特定细胞特征通常需要经过几代细胞的传递（细胞分裂）。代细胞的传递（细胞分裂）。4.4.影响细胞分化的因素影响细胞分化的因素la a激素激素lb蔗糖浓度lc 光照与温度a.a.激素激素生长素能促进维管组织形成生长素能促进维管组织形成细胞分裂素与木质部的发生有关细胞分裂素与木质部的发生有关 激素在细胞分化中的作用，可能是通过在转录或翻译水激素在细胞分化中的作用，可能是通过在转录或翻译水平上的调节作用而影响相关基因的表达从而调控细胞分平上的调节作用而影响相关基因的表达从而调控细胞分化。化。b b、蔗糖浓度、蔗糖浓度C、光照与温度光照对于维管组织的分化具有促进作用，适宜的光照对于维管组织的分化具有促进作用，适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。温度对于维管组织的分化是必需的。2.2.器官发生器官发生一离体培养中器官发生的方式一离体培养中器官发生的方式二二.器官分化的过程器官分化的过程三三.影响器官分化的因素影响器官分化的因素植物的离体器官的发生：培养条件下的组织或细胞植物的离体器官的发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的）等器官的过程。过程。不定根：不定根：从茎、叶上生出的根叫做不定根从茎、叶上生出的根叫做不定根不定芽不定芽：不是从叶腋或枝顶发出，而是从叶子、：不是从叶腋或枝顶发出，而是从叶子、根上或从树干上发出的芽根上或从树干上发出的芽 一一.离体培养中器官发生的方式离体培养中器官发生的方式 通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：第一种方式是先芽后根；如小麦，芦荟、苹果第一种方式是先芽后根；如小麦，芦荟、苹果 第二种方式为先根后芽；如枸杞、苜蓿等第二种方式为先根后芽；如枸杞、苜蓿等 第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。如胡萝卜、石刁柏过维管组织的联系形成完整植株。如胡萝卜、石刁柏 石刁柏二二.器官分化的过程器官分化的过程离体条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生离体条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段：长阶段：1.外植体经过诱导形成愈伤组织。外植体经过诱导形成愈伤组织。2.生长中心的形成。生长中心的形成。3.器官原基及器官形成。器官原基及器官形成。生生长长中中心心（拟拟分分生生组组织织）器器官官原原基基芽芽形形成成l在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基，这一途径有两种情况，一是外可形成器官原基，这一途径有两种情况，一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，另一种情况是外植体形组织器官进而再生植株，另一种情况是外植体形成分生细胞团后在分生细胞团上直接形成器官原成分生细胞团后在分生细胞团上直接形成器官原基。基。l一般认为，芽和茎原基通常起源于培养组织中比一般认为，芽和茎原基通常起源于培养组织中比较表层的细胞，即外起源，而根原基则发生在组较表层的细胞，即外起源，而根原基则发生在组织较深处，是内起源。织较深处，是内起源。三三.影响器官分化的因素影响器官分化的因素1.1.外植体外植体-位置、状态及组织类型（芦荟、小麦）位置、状态及组织类型（芦荟、小麦）外植体的状态和组织类型影响诱导和分化的难易；外植体的状态和组织类型影响诱导和分化的难易；外植体的部位直接影响器官分化的类型。外植体的部位直接影响器官分化的类型。例如：芦荟例如：芦荟具有变态器官（如鳞茎、球茎、块茎等）的植物，具有变态器官（如鳞茎、球茎、块茎等）的植物，在培养中往往也容易形成相应的变态器官，如百在培养中往往也容易形成相应的变态器官，如百合、水仙等鳞茎类植物培养中往往易形成小鳞茎；合、水仙等鳞茎类植物培养中往往易形成小鳞茎；草石蚕、马铃薯等块茎植物培养中则可观察到块草石蚕、马铃薯等块茎植物培养中则可观察到块茎的形成。这一特性也使以变态器官为繁殖体的茎的形成。这一特性也使以变态器官为繁殖体的植物实现实验室工厂化生产种子提供了可能。植物实现实验室工厂化生产种子提供了可能。草石蚕 水仙百合2.2.生长调节剂生长调节剂 生长调节剂在细胞生长与个体发育中具有重要生长调节剂在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化在大多数情的调控作用。离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物生长调节剂来实况下是通过外源提供适宜的植物生长调节剂来实现的。种类、浓度和不同类型生长调节剂的比例现的。种类、浓度和不同类型生长调节剂的比例是影响根芽等分化的关键。是影响根芽等分化的关键。3.3.光照光照光照有利于光照有利于维管组织维管组织和和叶绿体形成叶绿体形成进而分化成芽。进而分化成芽。愈伤组织的诱导培养一般是在黑暗或弱光照条件下进行愈伤组织的诱导培养一般是在黑暗或弱光照条件下进行的，细胞中完全没有维管成分，当转入强光照条件下以的，细胞中完全没有维管成分，当转入强光照条件下以后，才能逐渐变绿并形成维管组织。后，才能逐渐变绿并形成维管组织。分化培养的初期连续光照能促进愈伤组织变绿，随后的昼分化培养的初期连续光照能促进愈伤组织变绿，随后的昼夜交替则有利于细胞极性的建立，从而促进器官分化。夜交替则有利于细胞极性的建立，从而促进器官分化。有些植物，只有在一定的光周期条件下才能分化芽，例有些植物，只有在一定的光周期条件下才能分化芽，例如天竺葵的愈伤组织进入器官分化培养，一般要在如天竺葵的愈伤组织进入器官分化培养，一般要在16h/d16h/d光照和光照和8h/d8h/d黑暗条件下才能分化芽。黑暗条件下才能分化芽。l天竺葵4.温度 愈伤组织诱导培养时，温度可以适当提高，而分愈伤组织诱导培养时，温度可以适当提高，而分化温度比诱导温度要低。化温度比诱导温度要低。例如烟草，愈伤组织生长时例如烟草，愈伤组织生长时3333仍可良好生长，而分化则仍可良好生长，而分化则必需在必需在1818条件下才适宜。条件下才适宜。与光周期相似，某些需要通过低温春化的植物，在离体培与光周期相似，某些需要通过低温春化的植物，在离体培养中器官形成有时也需要低温处理，特别是对于某些特养中器官形成有时也需要低温处理，特别是对于某些特殊目的的培养，例如菊苣根培养产生的愈伤组织，诱导殊目的的培养，例如菊苣根培养产生的愈伤组织，诱导分化时经低温处理可形成花芽，而在分化时经低温处理可形成花芽，而在2525下培养只能形下培养只能形成营养芽。成营养芽。l菊苣根3.3.离体培养下的遗传与变异离体培养下的遗传与变异一、培养细胞变异的类型一、培养细胞变异的类型二、变异原因二、变异原因三三.影响离体培养细胞遗传变异的因子影响离体培养细胞遗传变异的因子四四.体细胞无性系变异的诱导体细胞无性系变异的诱导五、优良变异的筛选方法五、优良变异的筛选方法六六.体细胞无性系变异的利用体细胞无性系变异的利用七、变异的抑制七、变异的抑制一、培养细胞变异的类型变异，由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的重变异，由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的重组和交换，因此，这些变异的发生可以说均属于组和交换，因此，这些变异的发生可以说均属于突变突变的范畴，由于它们没有发生有性过程，因此，我们把的范畴，由于它们没有发生有性过程，因此，我们把在组织培养条件下所表现的遗传与变异特征称之为体在组织培养条件下所表现的遗传与变异特征称之为体细胞遗传与变异，由此发展起来的一个新的遗传学分细胞遗传与变异，由此发展起来的一个新的遗传学分枝称为枝称为体细胞遗传学体细胞遗传学。离体培养中，组织、细胞、原生质体培养再生植株离体培养中，组织、细胞、原生质体培养再生植株中，会有各种各样的变异。例如，叶色、花色的变中，会有各种各样的变异。例如，叶色、花色的变异，株高、果实大小的变异，染色体结构和数目的异，株高、果实大小的变异，染色体结构和数目的培养细胞变异的类型：培养细胞变异的类型：自发产生的变异。自发产生的变异。培养物在未加诱变因素的情况下产生变异。培养物在未加诱变因素的情况下产生变异。诱发产生的变异。诱发产生的变异。培养物在诱变因素作用下产生变异。培养物在诱变因素作用下产生变异。前者变异率一般在前者变异率一般在10-710-6之间，后者一般之间，后者一般在在10-510-4。1、自发产生的变异、自发产生的变异A.A.染色体多倍性和非整倍性染色体多倍性和非整倍性B.畸形变异 最常见的变异是白化苗突变，其次是产生最常见的变异是白化苗突变，其次是产生丛生芽、肉质茎芽等。丛生芽、肉质茎芽等。安祖花C.非遗传变异a a、外遗传变异（、外遗传变异（epigenetic variation)epigenetic variation)在植物愈伤组织培养过程中，常常出现一种不涉及基因结构在植物愈伤组织培养过程中，常常出现一种不涉及基因结构的变化，而只是在基因表达水平上的变异，如最常见的生长的变化，而只是在基因表达水平上的变异，如最常见的生长素自养型变异。这种变异不能通过有性世代传递给后代植株，素自养型变异。这种变异不能通过有性世代传递给后代植株，但在离体条件下却可以经过培养继代，长期保存。（马铃薯）但在离体条件下却可以经过培养继代，长期保存。（马铃薯）b b、生理适应（、生理适应（physiologic adaptationphysiologic adaptation）变异）变异 通常是在某种外界条件存在时才表现出变通常是在某种外界条件存在时才表现出变 异，外界条件不存在时，变异也随之消失。异，外界条件不存在时，变异也随之消失。2、诱发产生的变异、诱发产生的变异抗镰刀菌毒素细胞变异系的分离抗镰刀菌毒素细胞变异系的分离将诱导产生的愈伤组织接种在含不同浓度梯度毒素的培养基上将诱导产生的愈伤组织接种在含不同浓度梯度毒素的培养基上筛选得到半致死剂量浓度、筛选得到半致死剂量浓度、100%100%生长抑制生长浓度、生长抑制生长浓度、致死计致死计量浓度量浓度以半致死剂量为最低浓度，逐代增加毒素浓度至致死剂量浓度以半致死剂量为最低浓度，逐代增加毒素浓度至致死剂量浓度 转移至无毒素培养基继代培养两代转移至无毒素培养基继代培养两代转移到致死剂量和高于致死剂量的培养基培养，统计存活率转移到致死剂量和高于致死剂量的培养基培养，统计存活率二、变异原因：二、变异原因：1、植物本身的异质性植物本身的异质性无性繁殖植物的体细胞中，存在广泛的异质无性繁殖植物的体细胞中，存在广泛的异质性（如体细胞突变等原因造成），在整体中性（如体细胞突变等原因造成），在整体中被掩盖，无法表现出来。在离体培养中，原被掩盖，无法表现出来。在离体培养中，原来具有不同类型的细胞被诱导分裂，由这些来具有不同类型的细胞被诱导分裂，由这些变异的细胞再生的植株为变异植株，经过一变异的细胞再生的植株为变异植株，经过一定的选择，选育新品种。定的选择，选育新品种。2、培养条件引起的变异、培养条件引起的变异变异原因可能与如下因素有关：变异原因可能与如下因素有关：1）培养基中添加的激素培养基中添加的激素2）形成愈伤组织过程中，细胞分裂异常形成愈伤组织过程中，细胞分裂异常3）环境条件的改变（温度、光照时间及强环境条件的改变（温度、光照时间及强度与原来生长环境不同）度与原来生长环境不同）三三.影响离体培养细胞遗传变异的因子影响离体培养细胞遗传变异的因子1 1、供体植株方面、供体植株方面 倍性水平、基因型、外植体细胞的分化程度倍性水平、基因型、外植体细胞的分化程度2 2、培养基及培养方式、培养基及培养方式 培养基的成分、物理状态及培养类型培养基的成分、物理状态及培养类型原生质体培养原生质体培养的体细胞变异大于的体细胞变异大于细胞培养细胞培养的变异，的变异，而细胞培养的变异又大于而细胞培养的变异又大于组织器官培养组织器官培养的变异的变异3 3、继代培养的次数、继代培养的次数一般来讲，继代时间越长、继代次数越多，细胞变一般来讲，继代时间越长、继代次数越多，细胞变异的几率就越大。异的几率就越大。四四.体细胞无性系变异的诱导体细胞无性系变异的诱导自发变异往往频率较低，为了增加变异频自发变异往往频率较低，为了增加变异频率，在培养基中添加化学诱变剂或使用物率，在培养基中添加化学诱变剂或使用物理方法处理，这样，细胞群体中就会产生理方法处理，这样，细胞群体中就会产生各种各样的变异。各种各样的变异。诱变剂类型：诱变剂类型：诱变剂包括物理的和化学的两大类。诱变剂包括物理的和化学的两大类。物理诱变剂：物理诱变剂：X射线、射线、射线、中子、射线、中子、粒子、粒子、粒子和紫外线等。粒子和紫外线等。化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物、移码诱化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物、移码诱变剂和某些抗生素类等。变剂和某些抗生素类等。五、优良变异的筛选方法五、优良变异的筛选方法1、离体条件下体细胞无性系变异的筛选的优点：离体条件下体细胞无性系变异的筛选的优点：（1）可以在小空间内对大量个体进行选择）可以在小空间内对大量个体进行选择（2）不受季节限制，筛选效率高）不受季节限制，筛选效率高（3）诱变和筛选条件可以根据需要进行调节和控）诱变和筛选条件可以根据需要进行调节和控 制，提高了试验的重复性。制，提高了试验的重复性。（4）理化诱变剂可较均匀接触细胞，因此可以引）理化诱变剂可较均匀接触细胞，因此可以引 起培养细胞较高频率发生突变，增加了选择起培养细胞较高频率发生突变，增加了选择 机会机会（5）变异是在单细胞水平上进行的，因此一个突变）变异是在单细胞水平上进行的，因此一个突变 体来自一个细胞，避免了整株水平上常呈体来自一个细胞，避免了整株水平上常呈 现出的嵌合体，因而可以省去变异分离的麻烦现出的嵌合体，因而可以省去变异分离的麻烦2、体细胞变异材料的选择、体细胞变异材料的选择选择起始材料需根据试验目标确定，一般应考虑选择起始材料需根据试验目标确定，一般应考虑（1）目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然）目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。的目的。（2）必须充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，）必须充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生植株，则不能进行后继的技术不成熟，不能再生植株，则不能进行后继的各项操作。各项操作。（3）适当的细胞类型也是提高体细胞突变系筛选）适当的细胞类型也是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。效率的重要条件。虽然各种状态下的培养细胞均可以作为分离突变细虽然各种状态下的培养细胞均可以作为分离突变细胞的来源，但实践中胞的来源，但实践中原生质体和悬浮细胞系原生质体和悬浮细胞系被优先被优先考虑。考虑。3、筛选方法、筛选方法（1）直接筛选法）直接筛选法在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。突变个体分离。最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体，如抗突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体，如抗除草剂、抗盐突变体的筛选，均可直接在培养基中除草剂、抗盐突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。另外也可以在再生植株水平上进行筛选。另外也可以在再生植株水平上进行筛选。培养及筛选过程（在细胞水平上）：培养及筛选过程（在细胞水平上）：组织、器官、愈伤组织、原生质体等组织、器官、愈伤组织、原生质体等 诱发变异处理、筛选压诱发变异处理、筛选压 耐性愈伤组织耐性愈伤组织 再生植株再生植株 鉴定鉴定 耐性植株耐性植株培养及筛选过程（在再生植株水平上）：培养及筛选过程（在再生植株水平上）：组织、器官、愈伤组织、原生质体等组织、器官、愈伤组织、原生质体等 诱发变异处理诱发变异处理 愈伤组织愈伤组织 再生植株再生植株 筛选压筛选压 耐性植株耐性植株2、间接筛选法、间接筛选法 间接选择法是一种借助于与突变表现型有关间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。虑采用间接筛选法。抗病突变体的筛选也常常用间接筛选的策略。抗病突变体的筛选也常常用间接筛选的策略。由于在离体培养中直接接种病原物会严重阻碍细胞由于在离体培养中直接接种病原物会严重阻碍细胞生长，因此可以在培养基中加入一定剂量的病原物生长，因此可以在培养基中加入一定剂量的病原物类毒素来增加选择压力。类毒素来增加选择压力。体细胞无性系变异的表示方法主要有两种：体细胞无性系变异的表示方法主要有两种：（1）、）、Chaleff提出的以提出的以R0、R1、R2、.分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代后的世代（2）Larkin和和Scowcroft提出的提出的SC1、RC2、RC3.分别代表当代和自交以后的分别代表当代和自交以后的世代世代六、体细胞无性系变异的利用六、体细胞无性系变异的利用1创造育种中间材料或直接筛选新品种创造育种中间材料或直接筛选新品种据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要作物。在全世界作物。在全世界50多个国家中，已培育出多个国家中，已培育出1000多个多个由直接突变获得的或由这些突变体杂交而衍生的品由直接突变获得的或由这些突变体杂交而衍生的品种。这些品种的主要特性包括品质改良、增强抗病种。这些品种的主要特性包括品质改良、增强抗病性和抗逆性等性和抗逆性等2遗传研究遗传研究突变体作为基因克隆和标记筛选具有独特的优点。因为突变一旦发生，即可在表现型上与供体显著不同，通过差异显示或分子杂交筛选，即可快速获得突变位点的DNA序列，经过测序与功能鉴定，就可能获得与突变性状相关的基因。即使通过分析不能获得功能基因，这些DNA序列也可作为与突变性状相关的分子标记，用于相关遗传研究。突变体用于基因克隆和功能鉴定早已成为模式植物如拟南芥等的常规方法，近年来也已开始广泛用于其它作物中。特别是与转座子标签插入突变技术相结合，更显现出这一途径的高效性。目前，利用突变体策略已分离出一些功能基因和抗病基因，如玉米乙醇脱氢酶基因ADH，赤霉素合成相关基因GA1、GA4，生长素敏感性基因AUX1、AUX2、番茄抗病基因Df9等。3发育生物学研究植物的个体发育是一个渐进过程，每一个器官和组织的分化都是一个复杂的调控过程。利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控研究取得了突破性进展。特别是利用拟南芥和金鱼草等模式植物，已分离出一大批不同发育阶段和组织类型的突变体，包括顶端分生组织、根、开花转变、花序、花分生组织、胚胎发育等的一系列突变体。通过对这些突变体的研究，不仅建立了器官发育模式，而且分离鉴定了一大批与发育有关的基因，包括维持正常发育状态的基因、促进发育进程的基因，以及相关修饰基因4生化代谢途径研究生化代谢途径研究生物的各种代谢活动涉及到一系列酶相关生物的各种代谢活动涉及到一系列酶相关基因的表达。如果某一代谢过程的关键酶基基因的表达。如果某一代谢过程的关键酶基因突变，则会影响到下游代谢链的正常进行。因突变，则会影响到下游代谢链的正常进行。因此，突变体作为代谢活动调控研究的工具，因此，突变体作为代谢活动调控研究的工具，具有十分便利和高效的优势。具有十分便利和高效的优势。七、变异的抑制七、变异的抑制在脱毒苗生产、快速繁殖等工作中，变异往在脱毒苗生产、快速繁殖等工作中，变异往往会影响产品的产量和质量。所以，应采用往会影响产品的产量和质量。所以，应采用一定的方法避免变异。一定的方法避免变异。抑制变异可从以下几点考虑：抑制变异可从以下几点考虑：1、利用比较稳定的品种材料。、利用比较稳定的品种材料。2、利用茎尖、幼胚等再生能力较强、利用茎尖、幼胚等再生能力较强 的组织进行培养。的组织进行培养。3、避开使用高浓度激素。避开使用高浓度激素。4、不经过愈伤组织，而直接从脱分、不经过愈伤组织，而直接从脱分 化细胞再生。化细胞再生。5、尽量促使植株早再生，使培养时、尽量促使植株早再生，使培养时 间缩短。间缩短。