第五讲 DNA的提取原理及提取技术

第五讲第五讲 DNA DNA的提取原理及的提取原理及提取技术提取技术天然天然DNA的来源：的来源：1 染色体DNA 原核生物和真核生物均含有染色体DNA,它是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料。2 病毒和噬菌体DNA 主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。3 质粒DNA 很多微生物（大肠杆菌、农杆菌和蓝细菌）都含有质粒DNA，主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。4 线粒体和叶绿体DNA 这是真核生物特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸作用和光和作用相关的基因。主要用于分离目的基因。植物细胞的化学成分主要有植物细胞的化学成分主要有:1 水、糖类、蛋白质、脂肪以及核酸是生物体所需的基本成分；2 氨基酸是合成蛋白质的基本原料；3 果胶、纤维素、半纤维素是植物细胞壁的组成成分；4 淀粉是光合作用的产物；5 金属离子主要用来调节细胞的渗透平衡等，比如钾和钠，镁和锰是叶绿素的成分。植物总植物总DNA提取原则提取原则l保证DNA结构的完整性 l排除有机溶剂和金属离子的污染l蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度l排除其他核酸分子的污染植物植物DNA提取的基本原理提取的基本原理 DNA特点：DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNP在盐溶液中的溶解度随着盐浓度的增加而增加。植物植物DNA提取的基本原理提取的基本原理DNA提取基本步骤：1 细胞裂解和DNA的溶解 主要任务：破碎细胞并对DNA实施保护。采取措施：利用液氮研磨，使酶失活；快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。EDTA螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+,使DNA酶活性降低；SDS使蛋白质变性并降解蛋白质，也可降低DNA酶的活性；抗氧化剂抗氧化剂降低酚类氧化对DNA的干扰；PVP与多酚形成复杂的聚合体，与多糖结合，有效去除多糖；。植物植物DNA提取的基本原理提取的基本原理2 与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；主要利用DNA与蛋白质、多糖等在生化性质上的差别，通过加入离子变性剂，去污剂使蛋白质或多糖变性，核蛋白解聚。CTAB SDS除蛋白质l氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。l使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）l高盐洗涤(当溶液中的中性盐的浓度大于1mol/L 时，蛋白质会沉淀析出.)l蛋白酶处理除多糖l高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。l用多糖水解酶将多糖降解。l在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。除酚类物质l在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等l加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 除各种离子 70的乙醇洗涤 注意：我们在提取某种植物DNA时，需要考虑以上各种杂质的存在，根据某种植物DNA的具体情况采取相应的去除杂质的方法。植物植物DNA提取的基本原理提取的基本原理3 DNA的沉淀和纯化 沉淀：无水乙醇 TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,1mM EDTA.pH8.0）作用：作用：TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制 DNase PH值为8.0，可防止DNA发生酸解DNA的纯化技术的纯化技术琼脂糖凝胶电泳洗脱法 主要用于小剂量DNA的纯化和酶切片段的回收。1 DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带后，切取含有待纯化DNA带的琼脂糖凝胶电泳块，装入透析袋中；2 透析袋中加入适量经稀释的电泳缓冲液，并置于稀释的电泳缓冲液中电泳1-2h，使DNA脱离琼脂糖凝胶；DNA的纯化技术的纯化技术琼脂糖凝胶电泳洗脱法3 再反向电泳30s-1min，使附着在透析袋膜上的DNA重新进入缓冲液中；4 吸取透析袋中的洗脱液置于离心管中，以10000r/min离心5min,转移上清液到另一个离心管中，加入3M NaAc，再加入2体积无水乙醇，-20放置1.5min以上；DNA的纯化技术的纯化技术琼脂糖凝胶电泳洗脱法 5 4 ，12000 r/min离心20min，弃上清，沉淀在空气中晾干，溶于TE中，-20保存备用。DNA提取技术提取技术一、染色体一、染色体DNA的提取的提取 CTAB法法 （hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴，十六烷基三甲基溴化铵）化铵）SDS法法 （十二烷基磺酸钠，（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate,简称简称SDS）二、非染色体二、非染色体DNA的提取的提取 质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法 线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法CTAB法（植物DNA提取经典方法）原理：原理：CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合与核酸形成复合物。物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀。通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。CTAB提取缓冲液的配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使）使用前加入用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；Tris(三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷)EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除去除CTAB提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使）使用前加入用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。CTAB法提取植物法提取植物DNA的操作步骤的操作步骤1 称取25g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，加入15mL预热（6065）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65水浴保温0.51h，不时地轻轻摇动混匀。CTAB法提取植物法提取植物DNA的操作步骤的操作步骤2 加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。3 将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4 000r/min离心5min，静置，离心管中出现3层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。CTAB法提取植物法提取植物DNA的操作步骤的操作步骤4 根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。5 收集上层清液，并将其倒入离心管中。慢慢加入12倍体积预冷的70%乙醇。可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）。离心，即得到DNA粗制品。6 CTAB法提取植物法提取植物DNA的操作步骤的操作步骤6 上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它杂质。若要制取较纯的DNA，可将粗制品溶于TE缓冲液中，加入10mg/mL的RNase溶液，使其终浓度达50g/mL，混合物于37水浴中保温30min除去RNA。CTAB法提取植物法提取植物DNA的操作步骤的操作步骤7 70乙醇沉淀DNA。最后，将DNA溶于250L 的TE缓冲液中。CTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液 为了保证植物为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？注意什么？（1）整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源DNase对DNA的降解；（2）当DNA处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 原理：在碱性条件下线状DNA发生变性，质粒DNA维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA会形成沉淀，从而将质粒DNA与染色体DNA分开。质粒质粒DNA的提取碱裂解法的提取碱裂解法l 染色体染色体DNA比质粒比质粒DNA分子大得多，且染色分子大得多，且染色体体DNA为线状分子，而质粒为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环为共价闭合环状分子；状分子；l 当用碱处理当用碱处理DNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNA容容易发生变性，共价闭环的质粒易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性在回到中性pH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象；l 变性染色体变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。两者分开。l溶液溶液I I （50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mMTris-HCl pH8.0）作用：分散细胞作用：分散细胞 溶液溶液IIII (0.2mol/L NaOH,1%SDS)(SDS,十二烷基硫酸钠）十二烷基硫酸钠）作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。变性。溶液溶液IIIIII （3mol/L KAc,PH4.6）作用：酸性下质粒作用：酸性下质粒DNADNA复性，变性蛋白、线性复性，变性蛋白、线性DNADNA沉淀。沉淀。提取大肠杆菌质粒提取大肠杆菌质粒DNA的步骤的步骤1 取制备好的菌液1.5ml通过离心沉淀得到的菌体悬浮于100ul预冷的溶液中，震荡使细胞分散。2 在冰水浴中5min后，加入200ul溶液，快速颠倒几次，使充分混匀。此时，混合液的PH值在12.6，使细胞壁破裂，DNA变性。3 DNA的分离抽提。将离心管置于冰水浴中5min后，加入150mL预冷的溶液，颠倒离心管和震荡10s，使其混匀。置于冰水浴中5min。此时的PH值在7.0,使质粒DNA选择性复性，而染色体DNA随SDS和蛋白质一起沉淀下来。4 4，12000rpm离心5min，吸取上清液移到另一个离心管。5 去蛋白质，加氯仿/异戊醇6 重复47 向上清液中加入2体积的无水乙醇，-20下放置30min，沉淀DNA。8 4，12000rpm离心5min，弃上清液9 在超净工作台吹干10 加入50ulTE，-20保存备用。液氮罐液氮罐 制冰机制冰机高速冷冻离心机高速冷冻离心机思考题：1 植物基因组DNA提取原理与基本步骤2 大肠杆菌质粒DNA提取原理与基本步骤