实验八SDSPAGE测定蛋白质分子量

会计学1实验八实验八SDSPAGE测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 实验目的实验目的n n学习学习学习学习PAGEPAGEPAGEPAGE分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理n n学学学学习习习习SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE测测测测定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子量量量量的原理。的原理。的原理。的原理。n n掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。n n运运运运用用用用SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE测测测测定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子量量量量及染色鉴定。及染色鉴定。及染色鉴定。及染色鉴定。第1页/共38页一一.PAGEPAGE分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理n nPAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为连连续续系系统统和和不不连连续续系系统统两两大大类类，连连续续系系统统电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同，带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下，主主要要靠靠电电荷荷和和分分子子筛筛效效应应。不不连连续续系系统统中中由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分，pHpH，凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛筛效效应应，还还具具有有浓浓缩缩效效应应，因因而而其其分分离离条条带带清晰度及分辨率均较前者佳。清晰度及分辨率均较前者佳。第2页/共38页聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳-PAGE (Polyacryamide gel PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis)electrophoresis)n n以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。n n由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子混合物，而且可以研究生物大分子的分子混合物，而且可以研究生物大分子的特性；如电荷、分子量、等电点及分子构特性；如电荷、分子量、等电点及分子构型型。第3页/共38页聚丙烯酰胺凝胶的合成聚丙烯酰胺凝胶的合成聚丙烯酰胺凝胶的合成聚丙烯酰胺凝胶的合成丙稀酰胺丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶催化剂催化剂聚合反应聚合反应第4页/共38页聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构稀溶液稀溶液浓溶液浓溶液 交联剂交联剂 凝胶凝胶 结点结点T=X100%a+bmC=x100ba+bC=6.5-0.3T配制凝胶浓度配制凝胶浓度配制凝胶浓度配制凝胶浓度计算及经验公计算及经验公计算及经验公计算及经验公式式式式第5页/共38页凝胶浓度的计算凝胶浓度的计算n n聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数孔径大小均取决于两个重要参数孔径大小均取决于两个重要参数孔径大小均取决于两个重要参数T T和和和和C C，T T是丙烯酰胺和甲是丙烯酰胺和甲是丙烯酰胺和甲是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C C是与是与是与是与T T有关的交联有关的交联有关的交联有关的交联百分浓度。百分浓度。百分浓度。百分浓度。T T与与与与C C的计算公式是：的计算公式是：的计算公式是：的计算公式是：n n上式中上式中上式中上式中a a为丙烯酰胺的克数，为丙烯酰胺的克数，为丙烯酰胺的克数，为丙烯酰胺的克数，b b为甲叉双丙烯酰胺的克数，为甲叉双丙烯酰胺的克数，为甲叉双丙烯酰胺的克数，为甲叉双丙烯酰胺的克数，mm为水或缓冲液体积（为水或缓冲液体积（为水或缓冲液体积（为水或缓冲液体积（mlml）。式中）。式中）。式中）。式中a a与与与与b b的比例很重要。富的比例很重要。富的比例很重要。富的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，有弹性，且完全透明的凝胶，有弹性，且完全透明的凝胶，有弹性，且完全透明的凝胶，a a与与与与b b的重量比应在的重量比应在的重量比应在的重量比应在3030左右。左右。左右。左右。）第6页/共38页 聚丙烯酰胺的聚合及影响因素聚丙烯酰胺的聚合及影响因素聚丙烯酰胺的聚合及影响因素聚丙烯酰胺的聚合及影响因素 化学聚合：以过硫酸铵（化学聚合：以过硫酸铵（化学聚合：以过硫酸铵（化学聚合：以过硫酸铵（APAPAPAP）为催化剂，以四甲级乙二胺）为催化剂，以四甲级乙二胺）为催化剂，以四甲级乙二胺）为催化剂，以四甲级乙二胺（TEMEDTEMEDTEMEDTEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。连锁反应形成网状的聚合物。连锁反应形成网状的聚合物。连锁反应形成网状的聚合物。n n 丙稀酰胺由过硫酸铵（丙稀酰胺由过硫酸铵（丙稀酰胺由过硫酸铵（丙稀酰胺由过硫酸铵（APAPAPAP）在碱性条件下产生游离氧自）在碱性条件下产生游离氧自）在碱性条件下产生游离氧自）在碱性条件下产生游离氧自由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性 PH PH PH PH 时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚合速率减慢。聚合速率减慢。聚合速率减慢。聚合速率减慢。n n 在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在 25 25 25 25 聚合的凝胶则较透明和有弹性。聚合的凝胶则较透明和有弹性。聚合的凝胶则较透明和有弹性。聚合的凝胶则较透明和有弹性。n n分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2O2O2O2使过硫酸铵使过硫酸铵使过硫酸铵使过硫酸铵（APAPAPAP）分解。故在做胶后常要用水进行封闭；）分解。故在做胶后常要用水进行封闭；）分解。故在做胶后常要用水进行封闭；）分解。故在做胶后常要用水进行封闭；n n金属离子也干扰凝胶的化学聚合。金属离子也干扰凝胶的化学聚合。金属离子也干扰凝胶的化学聚合。金属离子也干扰凝胶的化学聚合。第7页/共38页光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下,分解成无色的还原型，在少量的分解成无色的还原型，在少量的分解成无色的还原型，在少量的分解成无色的还原型，在少量的O2O2O2O2条件下，条件下，条件下，条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。聚合反应发生。聚合反应发生。聚合反应发生。n n用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象；用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象；用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象；用量少，不会对样品有任何不良的干扰现象；故常用于样品胶的聚合；故常用于样品胶的聚合；故常用于样品胶的聚合；故常用于样品胶的聚合；n n聚合的时间可以自由控制聚合的时间可以自由控制聚合的时间可以自由控制聚合的时间可以自由控制n n缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好；缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好；缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好；缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好；n n光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合各种凝胶的聚合。合各种凝胶的聚合。合各种凝胶的聚合。合各种凝胶的聚合。核黄素B1 还原型 游离基 聚合反应光照光照O2第8页/共38页 聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应n n凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。n n大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影响响响响n n凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Size sieving capacitySize sieving capacitySize sieving capacitySize sieving capacity），故将此现象称为分子筛效应），故将此现象称为分子筛效应），故将此现象称为分子筛效应），故将此现象称为分子筛效应（Molecular sieving effectMolecular sieving effect）.n n有效孔径取决于凝胶的总浓度有效孔径取决于凝胶的总浓度有效孔径取决于凝胶的总浓度有效孔径取决于凝胶的总浓度 T T T T，孔径随着，孔径随着，孔径随着，孔径随着 T%T%T%T%的增加而减小。的增加而减小。的增加而减小。的增加而减小。甲基双丙稀酰胺的浓度为甲基双丙稀酰胺的浓度为甲基双丙稀酰胺的浓度为甲基双丙稀酰胺的浓度为5%5%5%5%时，有效孔径最小；时，有效孔径最小；时，有效孔径最小；时，有效孔径最小；T=5%T=5%T=5%T=5%时，甲基双丙时，甲基双丙时，甲基双丙时，甲基双丙稀酰胺的浓度为稀酰胺的浓度为稀酰胺的浓度为稀酰胺的浓度为5%5%5%5%时，孔径为时，孔径为时，孔径为时，孔径为20nm20nm20nm20nm。n nT T T T是凝胶溶质的总百分浓度，是凝胶溶质的总百分浓度，是凝胶溶质的总百分浓度，是凝胶溶质的总百分浓度，C C C C是与总浓度相关的交联百是与总浓度相关的交联百是与总浓度相关的交联百是与总浓度相关的交联百分浓度。故分浓度。故分浓度。故分浓度。故T T T T是决定是决定是决定是决定C C C C，分离物的分子量的大小又决定了，分离物的分子量的大小又决定了，分离物的分子量的大小又决定了，分离物的分子量的大小又决定了T T T T的浓度。的浓度。的浓度。的浓度。第9页/共38页 5 7 9 11 13 15 T%A B凝胶浓度凝胶浓度T对样品迁移率的影响对样品迁移率的影响例：混合蛋白质例：混合蛋白质A,BA,B，A A分子量较小，分子量较小，B B分子带电荷较多，分子带电荷较多，T T5 5时，电泳行为主要以电荷起作用，时，电泳行为主要以电荷起作用，B B 迁移速度快。当迁移速度快。当 T T 增加，分子筛效应增加，增加，分子筛效应增加，B B的迁移速度减慢；的迁移速度减慢；T T 9 9 时，时，A A，B B的迁移率相同，不能分开，的迁移率相同，不能分开，T T 再增加，凝胶孔径更小，再增加，凝胶孔径更小，A A分子比分子比B B分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。迁迁移移率率第10页/共38页第11页/共38页 不连续凝胶电泳（不连续凝胶电泳（不连续凝胶电泳（不连续凝胶电泳（discdiscdiscdisc）的分离原理）的分离原理）的分离原理）的分离原理(一一一一).).原理原理原理原理n n不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的 电荷效应电荷效应电荷效应电荷效应分分分分离外，还具有离外，还具有离外，还具有离外，还具有浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应与与与与分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应，因而，能，因而，能，因而，能，因而，能提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。碱性不连续分离酸性样品碱性不连续分离酸性样品碱性不连续分离酸性样品碱性不连续分离酸性样品n n不连续凝胶电泳洗脱不连续凝胶电泳洗脱不连续凝胶电泳洗脱不连续凝胶电泳洗脱 酸性不连续分离碱性样品酸性不连续分离碱性样品酸性不连续分离碱性样品酸性不连续分离碱性样品 大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行电泳分离。电泳分离。电泳分离。电泳分离。第12页/共38页.浓缩效应浓缩效应浓缩效应浓缩效应 1 1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径凝胶的组成：浓缩胶为大孔径凝胶的组成：浓缩胶为大孔径凝胶的组成：浓缩胶为大孔径（稀）（稀）（稀）（稀）T T T T5 5 5 5，分离胶一般为小，分离胶一般为小，分离胶一般为小，分离胶一般为小孔径（浓）孔径（浓）孔径（浓）孔径（浓）T7.5T7.5T7.5T7.5。样品在较。样品在较。样品在较。样品在较稀的凝胶上自由迁移，直至浓凝稀的凝胶上自由迁移，直至浓凝稀的凝胶上自由迁移，直至浓凝稀的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时，便形成一道栅栏，所有的胶时，便形成一道栅栏，所有的胶时，便形成一道栅栏，所有的胶时，便形成一道栅栏，所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成样品分子在浓缩胶的界面堆积成样品分子在浓缩胶的界面堆积成样品分子在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得到浓缩，然后，再依一窄带，得到浓缩，然后，再依一窄带，得到浓缩，然后，再依一窄带，得到浓缩，然后，再依据分子量的大小进行电泳分离。据分子量的大小进行电泳分离。据分子量的大小进行电泳分离。据分子量的大小进行电泳分离。2.2.2.2.缓冲液的组成缓冲液的组成缓冲液的组成缓冲液的组成:图示。图示。图示。图示。PHPHPHPH系统的系统的系统的系统的不连续，各种分子的电荷之间的不连续，各种分子的电荷之间的不连续，各种分子的电荷之间的不连续，各种分子的电荷之间的差异进行分离。差异进行分离。差异进行分离。差异进行分离。3.3.3.3.缓冲体系的不连续，其中各组成缓冲体系的不连续，其中各组成缓冲体系的不连续，其中各组成缓冲体系的不连续，其中各组成的离子、快慢离子迁移快慢的差的离子、快慢离子迁移快慢的差的离子、快慢离子迁移快慢的差的离子、快慢离子迁移快慢的差别是影响样品浓缩效应的重要因别是影响样品浓缩效应的重要因别是影响样品浓缩效应的重要因别是影响样品浓缩效应的重要因素。素。素。素。4.4.4.4.离子的迁移速率及浓度的不连续离子的迁移速率及浓度的不连续离子的迁移速率及浓度的不连续离子的迁移速率及浓度的不连续又造成电场强度与电导率的变化。又造成电场强度与电导率的变化。又造成电场强度与电导率的变化。又造成电场强度与电导率的变化。第13页/共38页分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应n n移动界面到达浓缩胶和移动界面到达浓缩胶和移动界面到达浓缩胶和移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的分离胶界面时，凝胶的分离胶界面时，凝胶的分离胶界面时，凝胶的PHPHPHPH变化明显，缓冲液中变化明显，缓冲液中变化明显，缓冲液中变化明显，缓冲液中甘氨酸的觧离迅速增加，甘氨酸的觧离迅速增加，甘氨酸的觧离迅速增加，甘氨酸的觧离迅速增加，直至完全觧离出直至完全觧离出直至完全觧离出直至完全觧离出 gly-,gly-,gly-,gly-,其分子量小，迁移超过其分子量小，迁移超过其分子量小，迁移超过其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹蛋白质分子。而丧失夹蛋白质分子。而丧失夹蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶击的作用；同时，凝胶击的作用；同时，凝胶击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋的孔径变小，降低了蛋的孔径变小，降低了蛋的孔径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白白质的迁移率。故蛋白白质的迁移率。故蛋白白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的电压梯质分子在均一的电压梯质分子在均一的电压梯质分子在均一的电压梯度和度和度和度和PH PH PH PH 值中泳动，依其值中泳动，依其值中泳动，依其值中泳动，依其分子量的大小而分开。分子量的大小而分开。分子量的大小而分开。分子量的大小而分开。第14页/共38页电荷效应电荷效应电荷效应电荷效应 蛋白质所带的净电的性蛋白质所带的净电的性蛋白质所带的净电的性蛋白质所带的净电的性质和电荷量与分子的质和电荷量与分子的质和电荷量与分子的质和电荷量与分子的迁移率的关系，在同迁移率的关系，在同迁移率的关系，在同迁移率的关系，在同一电场强度中，在单一电场强度中，在单一电场强度中，在单一电场强度中，在单位时间内各分子迁移位时间内各分子迁移位时间内各分子迁移位时间内各分子迁移的距离的差别而到达的距离的差别而到达的距离的差别而到达的距离的差别而到达分离。分离。分离。分离。第15页/共38页操作操作操作操作1.1.垂直柱状，板状的垂直柱状，板状的垂直柱状，板状的垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳系不连续凝胶电泳系不连续凝胶电泳系不连续凝胶电泳系统的组成和配制；统的组成和配制；统的组成和配制；统的组成和配制；2.2.均一凝胶与梯度凝均一凝胶与梯度凝均一凝胶与梯度凝均一凝胶与梯度凝胶配制；胶配制；胶配制；胶配制；3.3.电极缓冲液系统；电极缓冲液系统；电极缓冲液系统；电极缓冲液系统；4.4.样品的准备；样品的准备；样品的准备；样品的准备；5.5.加样要求加样要求加样要求加样要求6.6.电泳电泳电泳电泳7.7.检测检测检测检测PH8.3PH6.7PH8.9PH8.3 垂直柱状，板状的不垂直柱状，板状的不垂直柱状，板状的不垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳系统连续凝胶电泳系统连续凝胶电泳系统连续凝胶电泳系统的组成和配制的组成和配制的组成和配制的组成和配制第16页/共38页缓冲液系统缓冲液系统缓冲液系统缓冲液系统n n浓缩凝胶缓冲液浓缩凝胶缓冲液浓缩凝胶缓冲液浓缩凝胶缓冲液0.5mol/L Tris-HCl,PH6.80.5mol/L Tris-HCl,PH6.8n n分离凝胶缓冲液分离凝胶缓冲液分离凝胶缓冲液分离凝胶缓冲液1.5mol/L Tris-HCl,PH8.81.5mol/L Tris-HCl,PH8.8电极缓冲液系统电极缓冲液系统电极缓冲液系统电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷）（三羟甲基氨基甲烷）（三羟甲基氨基甲烷）（三羟甲基氨基甲烷）0.2mol/Gly (0.2mol/Gly (甘氨甘氨甘氨甘氨酸酸酸酸)PH8.3)PH8.3n n样品缓冲液样品缓冲液样品缓冲液样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8,40%0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8,40%甘油、甘油、甘油、甘油、0.05mg/ml0.05mg/ml溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝n n样品缓冲液的要求：样品缓冲液的要求：样品缓冲液的要求：样品缓冲液的要求：选择合适的选择合适的选择合适的选择合适的PHPH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。第17页/共38页标准蛋白质样品标准蛋白质样品标准蛋白质样品标准蛋白质样品n n标准蛋白质样品：是一组（标准蛋白质样品：是一组（标准蛋白质样品：是一组（标准蛋白质样品：是一组（5 5 5 57 7 7 7种）种）种）种）已知的合适的分子量范围的、构形已知的合适的分子量范围的、构形已知的合适的分子量范围的、构形已知的合适的分子量范围的、构形相近的一套蛋白质，溶解在样品缓相近的一套蛋白质，溶解在样品缓相近的一套蛋白质，溶解在样品缓相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲液中备用。冲液中备用。冲液中备用。冲液中备用。样品的浓度样品的浓度样品的浓度样品的浓度n n分析目的、检测方法和样品的组成分析目的、检测方法和样品的组成分析目的、检测方法和样品的组成分析目的、检测方法和样品的组成是关键；是关键；是关键；是关键；未知样品浓度：未知样品浓度：未知样品浓度：未知样品浓度：0.10.10.10.120mg/ml20mg/ml20mg/ml20mg/ml考玛斯亮篮染色：考玛斯亮篮染色：考玛斯亮篮染色：考玛斯亮篮染色：1 1 1 12mg/ml2mg/ml2mg/ml2mg/ml银银银银 染染染染 色色色色 :0.02:0.02:0.02:0.020.2mg/ml0.2mg/ml0.2mg/ml0.2mg/ml 高纯度样品：高纯度样品：高纯度样品：高纯度样品：0.50.50.50.52mg/ml2mg/ml2mg/ml2mg/ml加样加样加样加样电泳电泳电泳电泳 光吸收光吸收光吸收光吸收检测检测检测检测 考玛斯亮篮染色考玛斯亮篮染色考玛斯亮篮染色考玛斯亮篮染色 染色染色染色染色 银银银银 染染染染 色色色色 第18页/共38页 二、二、二、二、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGESDS-PAGE）测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量 第19页/共38页 SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE，主要用于测定蛋白质亚基的分子量。与，主要用于测定蛋白质亚基的分子量。与，主要用于测定蛋白质亚基的分子量。与，主要用于测定蛋白质亚基的分子量。与其它方法相比，它不需要昂贵的仪器设备，操作简其它方法相比，它不需要昂贵的仪器设备，操作简其它方法相比，它不需要昂贵的仪器设备，操作简其它方法相比，它不需要昂贵的仪器设备，操作简便，能在较短的时间内得到结果，有较高的重复性。便，能在较短的时间内得到结果，有较高的重复性。便，能在较短的时间内得到结果，有较高的重复性。便，能在较短的时间内得到结果，有较高的重复性。且不需要非常纯的样品，因此是目前用于测定蛋白且不需要非常纯的样品，因此是目前用于测定蛋白且不需要非常纯的样品，因此是目前用于测定蛋白且不需要非常纯的样品，因此是目前用于测定蛋白质亚基的分子量的一种最好的方法。质亚基的分子量的一种最好的方法。质亚基的分子量的一种最好的方法。质亚基的分子量的一种最好的方法。第20页/共38页 实验原理实验原理n nSDS-SDS-SDS-SDS-聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳，是是是是在在在在聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶系系系系统统统统中中中中引引引引进进进进SDSSDSSDSSDS（十十十十二二二二烷烷烷烷基基基基硫硫硫硫酸酸酸酸钠钠钠钠），SDSSDSSDSSDS能能能能断断断断裂裂裂裂分分分分子子子子内内内内和和和和分分分分子子子子间间间间氢氢氢氢键键键键，破破破破坏坏坏坏蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的二二二二级级级级和和和和三三三三级级级级结结结结构构构构，强强强强还还还还原原原原剂剂剂剂能能能能使使使使半半半半胱胱胱胱氨氨氨氨酸酸酸酸之之之之间间间间的的的的二二二二硫硫硫硫键键键键断断断断裂裂裂裂，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质在在在在一一一一定定定定浓浓浓浓度度度度的的的的含含含含有有有有强强强强还还还还原原原原剂剂剂剂的的的的SDSSDSSDSSDS溶溶溶溶液液液液中中中中，与与与与SDSSDSSDSSDS分分分分子子子子按按按按比比比比例例例例结结结结合合合合，形形形形成成成成带带带带负负负负电电电电荷荷荷荷的的的的SDS-SDS-SDS-SDS-蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质复复复复合合合合物物物物，这这这这种种种种复复复复合合合合物物物物由由由由于于于于结结结结合合合合大大大大量量量量的的的的SDSSDSSDSSDS，使使使使蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质丧丧丧丧失失失失了了了了原原原原有有有有的的的的电电电电荷荷荷荷状状状状态态态态形形形形成成成成仅仅仅仅保保保保持持持持原原原原有有有有分分分分子子子子大大大大小小小小为为为为特特特特征征征征的的的的负负负负离离离离子子子子团团团团块块块块，从从从从而而而而降降降降低低低低或或或或消消消消除除除除了了了了各各各各种种种种蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子之之之之间间间间天天天天然然然然的的的的电电电电荷荷荷荷差差差差异异异异，由由由由于于于于SDSSDSSDSSDS与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的结结结结合合合合是是是是按按按按重重重重量量量量成成成成比比比比例例例例的的的的，因因因因此此此此在在在在进进进进行行行行电电电电泳泳泳泳时时时时，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子的的的的迁迁迁迁移移移移速速速速度度度度取取取取决决决决于于于于分分分分子子子子大大大大小小小小。当当当当分分分分子子子子量量量量在在在在15KD15KD15KD15KD到到到到200KD200KD200KD200KD之之之之间间间间时时时时，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的迁迁迁迁移移移移率率率率和和和和分分分分子子子子量量量量的的的的对对对对数数数数呈呈呈呈线线线线性性性性关关关关系系系系，符符符符合合合合下下下下式式式式：logMW=K-bXlogMW=K-bXlogMW=K-bXlogMW=K-bX，式式式式中中中中：MWMWMWMW为为为为分分分分子子子子量量量量，X X X X为为为为迁迁迁迁移移移移率率率率，k k k k、b b b b均均均均为为为为常常常常数数数数，若若若若将将将将已已已已知知知知分分分分子子子子量量量量的的的的标标标标准准准准蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的迁迁迁迁移移移移率率率率对对对对分分分分子子子子量量量量对对对对数数数数作作作作图图图图，可可可可获获获获得得得得一一一一条条条条标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线，未未未未知知知知蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质在在在在相相相相同同同同条条条条件件件件下下下下进进进进行行行行电电电电泳泳泳泳，根根根根据据据据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。第21页/共38页实验原理实验原理n n SDSSDSSDSSDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与是样品制备过程中蛋白质与是样品制备过程中蛋白质与是样品制备过程中蛋白质与SDSSDSSDSSDS的结合程度。的结合程度。的结合程度。的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：影响它们结合的因素主要有三个：影响它们结合的因素主要有三个：影响它们结合的因素主要有三个：1)1)1)1)溶液中溶液中溶液中溶液中SDSSDSSDSSDS单体的浓度，当单体浓度大于单体的浓度，当单体浓度大于单体的浓度，当单体浓度大于单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L1mmol/L1mmol/L1mmol/L时大多数蛋白质与时大多数蛋白质与时大多数蛋白质与时大多数蛋白质与SDSSDSSDSSDS结合的重量结合的重量结合的重量结合的重量比为比为比为比为1:1.41:1.41:1.41:1.4，如果单休浓度降到，如果单休浓度降到，如果单休浓度降到，如果单休浓度降到0.5 mmol/L0.5 mmol/L0.5 mmol/L0.5 mmol/L以以以以下时，两者的结合比仅为下时，两者的结合比仅为下时，两者的结合比仅为下时，两者的结合比仅为1:0.41:0.41:0.41:0.4这样就不能消这样就不能消这样就不能消这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDSSDSSDSSDS的充分结合，它们的重量比应该为的充分结合，它们的重量比应该为的充分结合，它们的重量比应该为的充分结合，它们的重量比应该为1:41:41:41:4或或或或1:31:31:31:32)2)2)2)样品缓冲液的离子强度。样品缓冲液的离子强度。样品缓冲液的离子强度。样品缓冲液的离子强度。SDSSDSSDSSDS电泳的样品缓冲电泳的样品缓冲电泳的样品缓冲电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是液离子强度较低，通常是液离子强度较低，通常是液离子强度较低，通常是10101010100mmol/L100mmol/L100mmol/L100mmol/L3)3)3)3)二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原第22页/共38页 实验原理实验原理n n采采采采用用用用SDS-SDS-SDS-SDS-聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳法法法法测测测测蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子量量量量时时时时，只只只只有有有有完完完完全全全全打打打打开开开开二二二二硫硫硫硫键键键键，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子才才才才能能能能被被被被解解解解聚聚聚聚，SDSSDSSDSSDS才才才才能能能能定定定定量量量量地地地地结结结结合合合合到到到到亚亚亚亚基基基基上上上上而而而而给给给给出出出出相相相相对对对对迁迁迁迁移移移移率率率率和和和和分分分分子子子子量量量量对对对对数数数数的的的的线线线线性性性性关关关关系系系系。因因因因此此此此在在在在用用用用SDSSDSSDSSDS处处处处理理理理样样样样品品品品同同同同时时时时往往往往往往往往用用用用巯巯巯巯基基基基乙乙乙乙醇醇醇醇处处处处理理理理，巯巯巯巯基基基基乙乙乙乙醇醇醇醇是是是是一一一一种种种种强强强强还还还还原原原原剂剂剂剂，它它它它使使使使被被被被还还还还原原原原的的的的二二二二硫硫硫硫键键键键不不不不易易易易再再再再氧氧氧氧化化化化，从从从从而而而而使使使使很很很很多不溶性蛋白质溶解而与多不溶性蛋白质溶解而与多不溶性蛋白质溶解而与多不溶性蛋白质溶解而与SDSSDSSDSSDS定量结合。定量结合。定量结合。定量结合。n n有有有有许许许许多多多多蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质是是是是由由由由亚亚亚亚基基基基（如如如如血血血血红红红红蛋蛋蛋蛋白白白白）或或或或两两两两条条条条以以以以上上上上肽肽肽肽链链链链（如如如如胰胰胰胰凝凝凝凝乳乳乳乳蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶）组组组组成成成成的的的的，它它它它们们们们在在在在SDSSDSSDSSDS和和和和巯巯巯巯基基基基乙乙乙乙醇醇醇醇作作作作用用用用下下下下，解解解解离离离离成成成成亚亚亚亚基基基基或或或或单单单单条条条条肽肽肽肽链链链链，因因因因此此此此这这这这一一一一类类类类蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质，测测测测定定定定时时时时只只只只是是是是它它它它们们们们的亚基或单条肽链的的亚基或单条肽链的的亚基或单条肽链的的亚基或单条肽链的MWMWMWMW。n n已已已已发发发发现现现现有有有有些些些些蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质不不不不能能能能用用用用SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE测测测测定定定定分分分分子子子子量量量量。如如如如电电电电荷荷荷荷异异异异常常常常或或或或构构构构象象象象异异异异常常常常的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质，带带带带有有有有较较较较大大大大辅辅辅辅基基基基的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质（某某某某些些些些糖糖糖糖蛋蛋蛋蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。n n一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。第23页/共38页 实验试剂和器材实验试剂和器材 1.1.材料：材料：材料：材料：低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒:低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200MW=66,200 兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白兔肌动蛋白 MW=43,000MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400 根据说明书处理标准蛋白根据说明书处理标准蛋白根据说明书处理标准蛋白根据说明书处理标准蛋白 样品：称样品：称样品：称样品：称3mg3mg样品，加样品，加样品，加样品，加2 ml2 ml蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。蒸馏水溶解。第24页/共38页2.2.实验试剂实验试剂实验试剂实验试剂 (1)30%(1)30%丙烯酰胺（丙烯酰胺（丙烯酰胺（丙烯酰胺（AcrAcr）：称）：称）：称）：称Acr30gAcr30g，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 （BisBis）0.8g0.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至，加蒸馏水至，加蒸馏水至100ml100ml，过滤后置棕色瓶中，过滤后置棕色瓶中，过滤后置棕色瓶中，过滤后置棕色瓶中，4 4贮存可用贮存可用贮存可用贮存可用1-21-2月。月。月。月。（2 2）10%SDS10%SDS（十二烷基硫酸钠）（十二烷基硫酸钠）（十二烷基硫酸钠）（十二烷基硫酸钠）（3 3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：称取分离胶缓冲液：称取分离胶缓冲液：称取分离胶缓冲液：称取 Tris18.2gTris18.2g加入加入加入加入50ml50ml水，用水，用水，用水，用1mol/L1mol/L盐酸调盐酸调盐酸调盐酸调pH8.9pH8.9，最最最最 后用蒸馏水定容至后用蒸馏水定容至后用蒸馏水定容至后用蒸馏水定容至100ml100ml。（4 4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl1.0mol/LpH6.8Tris-HCl浓缩胶缓冲液：称取浓缩胶缓冲液：称取浓缩胶缓冲液：称取浓缩胶缓冲液：称取 Tris12.1gTris12.1g，加入，加入，加入，加入50ml50ml水，用水，用水，用水，用1mol/L1mol/L盐酸调盐酸调盐酸调盐酸调pH6.8pH6.8，最后用蒸馏水定容至最后用蒸馏水定容至最后用蒸馏水定容至最后用蒸馏水定容至100ml100ml。（5 5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl0.05mol/LpH6.8Tris-HCl样品样品样品样品溶解溶解溶解溶解缓冲液：称取缓冲液：称取缓冲液：称取缓冲液：称取 Tris0.6gTris0.6g，加入，加入，加入，加入50ml50ml水，用水，用水，用水，用1mol/L1mol/L盐酸调盐酸调盐酸调盐酸调pH6.8pH6.8，最，最，最，最 后用蒸馏水容至后用蒸馏水容至后用蒸馏水容至后用蒸馏水容至100ml100ml。第25页/共38页（7 7）10%10%过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)（8 8）TEMEDTEMED（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺）（9 9）样品溶解液：）样品溶解液：）样品溶解液：）样品溶解液：SDSSDS（100mg100mg）+巯基乙醇（巯基乙醇（巯基乙醇（巯基乙醇（0.1ml0.1ml）+溴酚蓝（溴酚蓝（溴酚蓝（溴酚蓝（2mg2mg）+甘油（甘油（甘油（甘油（2g2g）+0.05mol/L pH8.3Tris-+0.05mol/L pH8.3Tris-HCl HCl（2ml2ml），最后定容至），最后定容至），最后定容至），最后定容至10ml10ml。（1010）固定液：取）固定液：取）固定液：取）固定液：取50%50%甲醇甲醇甲醇甲醇454ml454ml，冰乙酸，冰乙酸，冰乙酸，冰乙酸46ml46ml混匀。混匀。混匀。混匀。（1111）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125gR250 0.125g，加上述固定液，加上述固定液，加上述固定液，加上述固定液 250ml250ml，过滤后备用。过滤后备用。过滤后备用。过滤后备用。（1212）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸）脱色液：冰乙酸75ml75ml，甲醇，甲醇，甲醇，甲醇50ml50ml，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至，加蒸馏水定容至1000ml1000ml。（1313）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含）电极缓冲液（内含0.1%SDS0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨甘氨甘氨甘氨酸缓冲液酸缓冲液酸缓冲液酸缓冲液pH8.3pH8.3）：称）：称）：称）：称Tris6.0gTris6.0g，甘，甘，甘，甘 氨酸氨酸氨酸氨酸28.8g28.8g，加入，加入，加入，加入SDS1gSDS1g，加蒸馏，加蒸馏，加蒸馏，加蒸馏水使其溶解后定容至水使其溶解后定容至水使其溶解后定容至水使其溶解后定容至1000ml1000ml。2.2.实验试剂实验试剂实验试剂实验试剂第26页/共38页3.3.实验器材实验器材实验器材实验器材n n垂垂直直板板电电泳泳装置装置n n直直流流稳稳压压电电源源n n移液管移液管n n滤纸滤纸 n n微量注射器微量注射器n n大培养皿大培养皿第27页/共38页各部分凝胶配制各部分凝胶配制参看实验指导参看实验指导 P57第28页/共38页 操作步骤操作步骤 1.1.1.1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备准备准备准备2 2 2 2个干净的个干净的个干净的个干净的锥形瓶锥形瓶锥形瓶锥形瓶.2.2.2.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好.固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板坏玻璃板坏玻璃板坏玻璃板.3.3.3.3.按比例配好分离胶按比例配好分离胶按比例配好分离胶按比例配好分离胶,用移液管快速加入用移液管快速加入用移液管快速加入用移液管快速加入,大约大约大约大约 5cm5cm5cm5cm左右左右左右左右,之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水,静置静置静置静置40404040分钟分钟分钟分钟.凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速,催化剂催化剂催化剂催化剂TEMEDTEMEDTEMEDTEMED要在注胶要在注胶要在注胶要在注胶前再加入前再加入前再加入前再加入,否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次注胶过程最好一次注胶过程最好一次注胶过程最好一次性完成性完成性完成性完成,避免产生气泡避免产生气泡避免产生气泡避免产生气泡.第29页/共38页操作步骤操作步骤 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气空气空气空气 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面界面界面界面.4.4.4.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好按比例配好按比例配好按比例配好浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm5mm5mm处处处处,迅速迅速迅速迅速插入样梳插入样梳插入样梳插入样梳,静置静置静置静置40404040分钟分钟分钟分钟.样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡,梳底梳底梳底梳底需水平需水平需水平需水平.第30页/共38页操作步骤操作步骤5.5.5.5.在上槽内加入缓冲液后在上槽内加入缓冲液后在上槽内加入缓冲液后在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳拔出样梳拔出样梳拔出样梳。要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果否则会影响加样效果否则会影响加样效果否则会影响加样效果.6 6 6 6、加样加样加样加样（1 1）取取取取1010 l l标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于EPEP管内，再加入管内，再加入管内，再加入管内，再加入1010 l l 2 2倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为1010 l l。（2 2）取取取取1010 l l样品溶液，再加入样品溶液，再加入样品溶液，再加入样品溶液，再加入1010 l 2l 2倍样品缓冲液，上样倍样品缓冲液，上样倍样品缓冲液，上样倍样品缓冲液，上样量分别为量分别为量分别为量分别为5 5 l l和和和和3 3 l l。7.7.7.7.用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前加样前加样前加样前,样品在样品在样品在样品在 沸水中加热沸水中加热沸水中加热沸水中加热3 3 3 3分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳态聚合。注射器不可过低注射器不可过低注射器不可过低注射器不可过低,以防刺破胶体以防刺破胶体以防刺破胶体以防刺破胶体,也不可过高也不可过高也不可过高也不可过高,在样品下在样品下在样品下在样品下 沉时会发生扩散沉时会发生扩散沉时会发生扩散沉时会发生扩散.为避免边缘效应为避免边缘效应为避免边缘效应为避免边缘效应,最好选用中部的孔上样最好选用中部的孔上样最好选用中部的孔上样最好选用中部的孔上样.第31页/共38页操作步骤操作步骤8.8.8.8.电泳槽中加入缓冲液电泳槽中加入缓冲液电泳槽中加入缓冲液电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳接通电源，进行电泳接通电源，进行电泳接通电源，进行电泳，开始电流恒，开始电流恒，开始电流恒，开始电流恒定在定在定在定在10mA10mA，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为20mA20mA，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘约约约约5mm5mm时，停止电泳。时，停止电泳。时，停止电泳。时，停止电泳。9.9.9.9.凝胶板剥离凝胶板剥离凝胶板剥离凝胶板剥离与与与与染色染色染色染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1 1小时左右。小时左右。小时左右。小时左右。10.10.10.10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。脱色，直到蛋白质区带清晰。脱色，直到蛋白质区带清晰。脱色，直到蛋白质区带清晰。剥胶时要小心剥胶时要小心剥胶时要小心剥胶时要小心,保持胶完好无损保持胶完好无损保持胶完好无损保持胶完好无损,染色要充分染色要充分染色要充分染色要充分.11.11.11.11.实验结果分析实验结果分析实验结果分析实验结果分析。第32页/共38页分析计算分析计算绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。第33页/共38页思考题思考题n n为为什什么么PAGEPAGE具具有有较较高高的的分分辨辨率率？-回答三个效应及如何形成？回答三个效应及如何形成？n n在在不不连连续续体体系系SDS-PAGESDS-PAGE中中,当当分分离离胶胶加加完完后后,需需在在其其上上加加一一层层水水,为什么为什么?n n样样品品溶溶解解液液中中各各种种试试剂剂的的作作用用是什么是什么?n n在在不不连连续续体体系系SDS-PAGESDS-PAGE中中,分分离离胶胶与与浓浓缩缩胶胶中中均均含含有有TEMEDTEMED和和AP,AP,试述其作用试述其作用?第34页/共38页注意事项注意事项n n丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超过最大暴露量不超过0.5g/kg，皮肤接触可致，皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、