PCR技术及其应用.ppt

分 子 生 物 学 与 临 床 中 山 大 学 主 讲 ： 杨 中 汉 （ ） http:/ PCR技 术 诞 生 所 依 赖 的 社 会 需 求 和 研 究 需 要 20kB fragments插 入 噬 菌 体 载 体细 菌 扩 增 从 基 因 组 文 库 中 筛 选 目 的 基 因 probe 引 物1977年 引 物 引 物1983年 XX ( )40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 复温 3 PCR管 加 热 使 模 板 变 性 , 退 火 使 引 物 与 模 板 DNA互补 ,延 伸 需 将 反 应 温 度 升 至 中 温 ( 72 ),在 Tap多聚 酶 的 作 用 下 ,以 dNTP为 原 料 ,以 引 物 为 复 制 的 起点 ,合 成 新 链 。 如 此 重 复 改 变 反 应 温 度 ,即 高 温 变 性 、 低 温 退 火和 中 温 延 伸 三 个 阶 段 为 一 个 循 环 ,每 一 次 循 环 使 特异 区 段 的 基 因 拷 贝 数 放 大 一 倍 ,一 般 样 品 是 经 过 30次 循 环 ,最 终 使 基 因 放 大 了 数 百 万 倍 ; 将 扩 增 产 物进 行 电 泳 ,经 溴 化 乙 锭 染 色 ,在 紫 外 灯 照 射 下 肉 眼能 见 到 扩 增 特 异 区 段 的 DNA带 。 30次 1234 1234 A： 无 外 显 子 8,12,17,19对 应条 带 ,说 明 病 人 外 显 子 8 19缺 失B： 病 人 A中 未 扩 增 外 显 子带 的 强 度 为 C的 一 半 ,提 示 为区 域 缺 失 携 带 者C： 正 常 人 DMD基 因 外 显 子的 一 般 扩 增 形 式多 重 PCR检 测 DMD基 因 缺 失 PCR的 局 限 ： 需 了 解 靶 基 因 片 段 两 测 的 序 列 对 于 未 知 序 列 和 具 有 不 同 末 端 序 列 怎 么 办 ？（ 固 定 化 PCR） 锚 定 PCR首 先 合 成 第 一 链 cDNA,然 后 再 添 加 一 同 聚 物 尾 （ polydG),与同 聚 物 尾 配 对 的 3锚 定 引 物 （ 带 有 限 制 性 内 切 位 点 polydC)一 起 作PCR扩 增 可 用 于 基 因 芯 片 的 制 作 A.阳 性 对 照 B.阴 性 对 照 C.原 位 检 测 mRNA表 达 逆 转 录 酶 聚 合 酶 mRNAcDNA杂 化 双 链PCR扩 增 荧光标记 I 535 3SGExcitation SGSGSGSG Emission 535 3SGSG SGSG SGExcitation Emission Taqman探 针 3端 Q荧 光 分 子 能 够吸 收 5端 R荧 光 分 子 发 出 的 荧 光 ,因 此 ,正 常 情 况 下 该 探 针 检 测 不到 5端 荧 光 分 子 发 出 的 荧 光 ,只 能检 测 到 3端 荧 光 分 子 的 荧 光 信 号 ,但 当 溶 液 中 有 PCR 产 物 (模 板 ) 时,探 针 与 模 板 退 火 ,即 产 生 了 适 合于 核 酸 外 切 酶 活 性 的 底 物 ,从 而激 活 Taq 酶 的 5外 切 酶 活 性 ,将 探针 5端 连 接 的 R荧 光 分 子 从 探 针上 切 割 下 来 ,破 坏 了 两 个 荧 光 分子 间 的 FRET ,从 而 发 出 荧 光 ,切割 的 R荧 光 分 子 数 与 PCR 产 物 的数 量 成 比 例 ,因 此 ,根 据 PCR 反 应液 的 荧 光 强 度 即 可 计 算 出 初 始 模板 的 数 量荧 光 能 量 传 递 技 术 (fluorescence resonance energy transfer , FRET) Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640Excitation EmissionTransfer荧 光 共 振 能 量 传 递 （ FRET Probe） R Q 535 3535 3Excitation RR QExcitation双 标 记 探 针 （ Taqman Probe） R QExcitationR Q QRExcitation Emission分 子 信 标 （ Molecular Beacon Probe） 引 物 特 异 性 探 针 （ Amplisenor Probe） 535 3535 33 RQ5 R QR Q35 Q R RREmissionExcitationQ R引 物 特 异 性 探 针 （ Amplifluor Probe） 全新4通道实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 + 5 5 A 正 常 人A 病 人病 原 微 生 物 基 因 正 常 人 (-)病 人 (+) A PCR-ASO检 测 基 因 点 突 变 :主 是 利 用 PCR技术 扩 增 靶 基 因 的 适 当 片 段 ,然 后 用 人 工 合 成的 含 突 变 位 点 的 标 记 寡 核 苷 酸 探 针 杂 交 探 针 杂 交NC膜 探 针 HLA系 统 基 因 分 型 （ 序 列 特 异 性 引 物 -PCR技 术 ） 数 目 可 变 的 串 联 重 复 序 列 ） 现 嫌 1 嫌 2 嫌 3