抗生素生产工艺

抗 生 素 生 产 的 工 艺 过 程 菌 种 来 源 于 自 然 界 ， 获 得 能 产 生 抗 生 素 的 微 生 物 ，经 分 离 、 选 育 和 纯 化 后 即 称 为 菌 种 菌 种 的 保 藏 ： 冷 冻 干 燥 、 超 低 温 冷 冻 、 砂 土 管 、液 体 石 蜡 、 斜 面 低 温 保 藏 孢 子 制 备 将 保 藏 的 处 于 休 眠 状 态 的 孢 子 ， 接 种 至 固 体 斜面 培 养 基 ， 在 一 定 温 度 下 培 养 5-7或 7日 以 上 进 一 步 用 扁 瓶 在 固 体 培 养 基 上 扩 大 培 养 种 子 制 备 目 的 使 孢 子 发 芽 、 繁 殖 以 获 得 足 够 数量 的 菌 丝 ， 并 接 种 到 发 酵 罐 中 摇 瓶 或 直 接 将 孢 子 接 入 种 子 罐 逐 级 放 大培 养 种 子 培 养 定 时 取 样 作 无 菌 试 验 ， 观 察 菌丝 形 态 ， 测 定 种 子 液 中 发 酵 单 位 和 进 行生 化 分 析 种 子 级 数 培 养 基 的 配 制 碳 源 氮 源 无 机 盐 类 前 体 碳 源 供 给 菌 种 生 命 活 动 所 需 能 量 ， 构 成 菌 体细 胞 及 代 谢 产 物 参 与 抗 生 素 的 生 物 合 成 常 用 碳 源 ： 淀 粉 、 葡 萄 糖 及 油 脂 氮 源 构 成 菌 体 细 胞 物 质 和 含 氮 代 谢 物 参 与 含 氮 抗 生 素 合 成 有 机 氮 源 无 机 氮 源 无 机 盐 和 微 量 元 素 同 其 他 微 生 物 前 体 菌 体 利 用 其 构 成 抗 生 素 分 子 中 的 一 部 分而 其 本 身 没 有 显 著 改 变 的 物 质 一 定 条 件 下 控 制 菌 体 合 成 抗 生 素 的 方 向并 增 加 抗 生 素 的 产 量 发 酵 目 的 是 使 微 生 物 大 量 分 泌 抗 生 素 接 种 10% 通 气 搅 拌 控 制 罐 温 消 泡 控 制 pH 定 时 采 样 进 行 生 化 分 析 、 镜 检 ， 测 定 菌 体 浓 度 、残 糖 量 、 抗 生 素 含 量 等 发 酵 液 的 过 滤 和 预 处 理 分 离 菌 丝 、 去 除 杂 质 预 处 理 ： 去 除 高 价 无 机 离 子 和 蛋 白 质 过 滤 ： 去 除 固 形 物 及 菌 体 发 酵 液 的 预 处 理 草 酸 及 磷 酸 去 除 高 价 离 子 钙 、 镁 ， 还 能促 使 蛋 白 质 凝 固 黄 血 盐 有 利 于 去 除 铁 离 子 硫 酸 锌 有 利 于 凝 固 蛋 白 质 等 电 点 法 、 加 热 法 、 絮 凝 法 去 除 蛋 白 发 酵 液 的 过 滤 板 框 过 滤 机 鼓 式 真 空 过 滤 机 自 动 出 渣 离 心 机 倾 析 器 抗 生 素 的 提 取 溶 媒 萃 取 法 离 子 交 换 法 直 接 沉 淀 法 抗 生 素 的 精 制 药 品 生 产 符 合 GMP规 定 脱 色 及 去 除 热 原 质 结 晶 和 重 结 晶 脱 色 色 素 是 发 酵 过 程 中 产 生 的 代 谢 产 物 ， 与菌 种 及 发 酵 条 件 有 关 活 性 炭 脱 色 热 原 质 在 生 产 过 程 中 由 于 被 污 染 后 由 杂 菌 所 产生 的 一 种 内 毒 素 ， G-产 生 的 热 原 反 应 高于 G+， 是 多 糖 磷 类 脂 质 和 蛋 白 质 的 结 合 体 ，引 起 恶 寒 高 热 ， 甚 至 休 克 活 性 炭 吸 附 超 滤 去 除 进 一 步 精 制 结 晶 与 重 结 晶 共 沸 蒸 馏 法 柱 层 析 法 中 间 盐 转 移 法 分 子 筛 青 霉 素 的 生 产 工 艺 菌 种 ： 产 黄 青 霉 素（ Pen chrysogenum） 生 产 能 力 达 到 30000-60000/mLSNORCONH CH3CH3COOH C CH 3_ COOHNH2CH3 CH_ O NH_CH- 工 艺 流 程冷 冻 管 斜 面 母 瓶 大 米 孢 子 一 级 种 子 罐 二 级 种 子 罐 发 酵 罐 放 罐 提 炼孢 子 培 养25 C,6-7d孢 子 培 养25 C,6-7d 发 酵25 C,40-45d 1:2VVM25 C,40-45d 1:1.5VVM种 子 培 养 种 子 培 养 22-26 C,6-7d 1:1-0.8VVM 冷 至 15 C 培 养 基 碳 源 ： 利 用 多 种 碳 源 和 乳 糖 、 蔗 糖 、 葡 萄 糖 等 。普 遍 采 用 淀 粉 经 酶 水 解 的 葡 萄 糖 糖 化 液 进 行 流加 氮 源 ： 可 选 用 玉 米 浆 、 花 生 饼 粉 、 精 制 棉 籽 饼粉 或 麸 质 粉 ， 并 补 加 无 机 氮 源 前 体 ： 为 生 物 合 成 含 有 苄 基 基 团 的 青 霉 素 G，在 发 酵 中 加 入 前 体 如 苯 乙 酸 或 苯 乙 酰 胺 ， 加 入量 不 能 大 于 0.1%， 采 用 多 次 加 入 方 式 无 机 盐 ： 硫 、 磷 、 钙 、 镁 、 钾 等 盐 类 青 霉 素 生 产 菌 生 长 发 育 阶 段 I期 分 生 孢 子 发 芽 II期 菌 丝 繁 殖 III期 形 成 脂 肪 粒 ， 积 累 贮 藏 物 IV期 脂 肪 粒 减 少 ， 形 成 中 、 小 空 泡 V期 形 成 大 空 泡 ， 脂 肪 粒 消 失 VI期 细 胞 内 看 不 到 颗 粒 ， 个 别 细 胞 出 现 自 溶 青 霉 素 生 产 菌 生 长 发 育 阶 段 I-IV期 为 菌 丝 生 长 期 ， 产 青 霉 素 较 少 ， 菌丝 浓 度 增 加 很 多 III期 适 于 作 种 子 IV-V期 青 霉 素 分 泌 期 ， 菌 丝 生 长 趋 势 减弱 ， 大 量 产 生 青 霉 素 VI期 菌 丝 自 溶 期 发 酵 工 艺 控 制 温 度 控 制 ： 前 期 25-26 C， 后 期 23 C pH控 制 ： 一 般 为 6.4-6.6， 加 酸 加 碱 及 加葡 萄 糖 控 制 通 气 ： 一 般 为 1： 0.8VVM 搅 拌 ： 要 求 发 酵 液 中 溶 解 氧 量 不 低 于30%。 泡 沫 与 消 沫 ： 少 量 多 次 加 入 消 沫 剂 ， 在发 酵 前 期 不 宜 多 用 发 酵 工 艺 控 制 加 糖 控 制 ： 根 据 残 糖 量 与 发 酵 过 程 中 的pH来 控 制 ， 也 可 根 据 排 气 中 CO2与 O2量来 控 制 补 氮 ： 发 酵 液 氨 氮 控 制 在 0.01-0.05% 加 前 体 ： 残 余 苯 乙 酰 胺 浓 度 控 制 在 0.05-0.08% 过 滤 鼓 式 真 空 过 滤 器 提 炼 溶 媒 萃 取 法 ： 将 发 酵 滤 液 酸 化 至 pH2， 后加 相 当 于 发 酵 滤 液 体 积 1/3的 醋 酸 丁 酯 ，混 合 后 以 碟 片 式 离 心 机 分 离 ； 然 后 以 1.3-1.9%NaHCO3在 pH6.8-7.1条 件 下 将 青 霉 素提 取 到 缓 冲 液 中 ， 再 调 pH2， 将 青 霉 素 从缓 冲 液 转 入 到 醋 酸 丁 酯 溶 液 中 脱 色 在 提 取 液 中 加 活 性 炭 150-300g/10亿 单 位 ，进 行 脱 色 、 过 滤 共 沸 蒸 馏 将 萃 取 液 以 0.5mol/LNaOH液 萃 取 ， 调 pH至 6.4-6.8， 加 3-4倍 体 积 丁 醇 ， 在 16-26 C， 5mmHgG下 真 空 蒸 馏 ， 将 水 与 丁醇 共 沸 物 蒸 出 ， 并 随 时 补 加 丁 醇 。 当 浓缩 到 原 来 水 浓 缩 液 体 积 、 蒸 出 馏 分 中 含水 达 2-4%时 ， 停 止 蒸 馏 ， 青 霉 素 钠 盐 结晶 析 出 ， 过 滤 ， 洗 涤 ， 干 燥 得 成 品 。 土 霉 素 生 产 菌 种 : 龟 裂 链 霉 菌 （ Streptomyces Rimosus） 菌 落 灰 白 色 ， 后 期 生 皱 褶 ， 呈 龟 裂 状 。菌 丝 呈 树 枝 状 分 枝 ， 白 色 ， 孢 子 灰 白 色 、柱 形 生 产 工 艺 流 程砂 土 管 孢 子 斜 面 孢 子 一 级 种 子 二 级 种 子发 酵 提 取 37C4-5天320.5C 310.5C30-32h 24-26h32C-310.5C- 32C160h 砂 土 管 黄 沙 ： 土 = 1： 1（ 沙 和 土 都 经 处 理 ， 水洗 至 中 性 ， 烘 干 ， 研 细 ， 过 筛 ） 每 管 装 一 定 量 的 砂 土 ， 塞 好 棉 塞 包 好 ，121 高 压 蒸 汽 灭 菌 后 再 用 160 干 热 灭菌 2h 每 支 砂 土 管 加 0.3mL孢 子 悬 浮 液 ， 包 好 ，放 入 装 有 干 燥 剂 的 真 空 干 燥 剂 内 抽 干 6-12 h， 轻 轻 敲 打 使 其 均 匀 。 完 后 ， 放 入 装有 干 燥 剂 的 密 闭 瓶 内 ， 0-4 贮 藏 斜 面250 ml茄 子 瓶 麸 皮 4%， 麦 粉 2%， 琼 脂 2% 一 级 种 子 400-500L夹 套二 级 种 子 4m3（ 搅 拌 ） 发 酵15%接 种 量培 养 基 ： 碳 源 ： 淀 粉 经 -淀 粉 酶 液 化 氮 源 ： 黄 豆 饼 粉 ， 硫 铵 无 机 盐 ： KH2PO4， NaCl ， CaCO3，CoCl2 生 长 因 子 ： 酵 母 粉 ， 玉 米 浆 采 用 中 间 补 料 ， 延 长 抗 生 素 分 泌 期 ，是 提 高 抗 生 素 产 量 的 重 要 方 法 。 土 毒 素生 产 过 程 采 用 补 糖 与 补 氨 ， 以 保 证 其 在分 泌 期 有 足 够 多 而 不 过 多 的 养 料 。 总 糖 前 期 0-80 h 6.5-8% 中 期 80-120 h 5-6.5 % 后 期 120-140 h 4-5 % 末 期 140 h后 4% 放 罐 残 糖 3%以 下 ， 放 罐 前 24 h不 补 料 补 氨 同 时 为 调 pH， pH=6.0-6.3， 放 罐前 8 h停 止 通 氨 ， 整 个 过 程 通 氨 水 总量 350-400升 预 处 理 土 霉 素 能 和 发 酵 液 中 钙 盐 、 镁盐 ， 某 些 有 机 胺 、 蛋 白 质 形 成 不 溶性 化 合 物 ， 积 聚 在 体 内 。 预 处 理 目 的 为 ： 1） 使 部 分 土 霉 素 溶 液 解 出 来 2） 蛋 白 质 （ 菌 丝 ） 沉 淀 3） Fe3+沉 淀 提 取 工 艺 发 酵 液 酸 化 液 +低 单 位 套 液 稀 释 液 净 化 液 加 草 酸 及 盐 酸 酸 化 pH1.7 并 加 适 量 黄 血 盐 ， 搅 30 (26000 r/ml)稀 释 到 7500-8000 r/ml 加 黄 血 盐 及 硫 酸 锌 净 化板 框 过 滤 滤 液 （ 土 霉 素 草 酸 ）滤 渣 （ 草 酸 钙 、 蛋 白 质 、 菌 体 、铁 络 合 物 ） 滤 液 脱 色 液 土 霉 素 + 草 酸 湿 晶 体 成 品 板 框 过 滤 离 心 氨 水 调 pH4.1-4.7 搅 50 气 流 干 燥 80-90C离 子 交 换 122#