病毒的细胞培养

病 毒 的 细 胞 培 养 赵 健 乔 一 基 本 原 理 二 细 胞 培 养 的 基 本 概 念 三 主 要 优 点 四 培 养 实 验 用 品 的 前 期 处 理 五 培 养 细 胞 的 生 长 方 式 及 类 型 六 细 胞 培 养 的 实 验 步 骤 七 病 毒 的 细 胞 培 养 一 基 本 原 理 通 过 机 械 解 离 或 消 化 等 方 法 将 组 织 或 细 胞 从 机 体取 出 ， 分 散 成 单 个 细 胞 ， 给 与 必 要 的 生 长 条 件 。模 拟 体 内 生 长 环 境 ， 使 其 在 体 外 能 继 续 生 长 与 增值 。 在 长 成 致 密 单 层 细 胞 后 ， 将 病 毒 接 种 在 细 胞 上 ，置 于 适 当 环 境 中 进 行 培 养 ， 逐 日 观 察 细 胞 病 变（ CPE） 待 75%的 细 胞 出 现 CPE后 收 获 细 胞 ， 反复 冻 融 3次 ， 置 -70 保 存 备 用 。 细 胞 培 养 的 基 本 概 念 传 代 ： 细 胞 在 培 养 器 皿 中 生 长 一 定 时 间 后 ，被 分 开 接 种 到 新 的 培 养 器 皿 中 。 原 代 培 养 ： 取 自 体 内 新 鲜 组 织 并 置 于 体 外条 件 下 生 长 的 细 胞 在 传 代 之 前 称 为 原 代 培养 。 二 主 要 优 点 研 究 的 对 象 是 活 的 细 胞 。 研 究 的 条 件 可 以 人 为 的 控 制 。 研 究 的 样 本 ， 可 以 达 到 比 较 均 一 性 。 研 究 的 内 容 便 于 观 察 、 检 测 和 记 录 。 研 究 的 范 围 比 较 广 泛 。 研 究 的 费 用 相 对 较 经 济 。 三 分 类 原 代 细 胞 培 养 传 代 细 胞 培 养 原 代 细 胞 培 养 概 念 ： 从 供 体 获 取 组 织 细 胞 后 在 体 外 进 行的 首 次 培 养 。 优 点 ： 生 物 学 特 性 未 发 生 很 大 变 化 ， 细 胞染 色 体 仍 为 二 倍 体 ， 接 近 和 反 映 体 内 生 长特 性 ， 适 合 做 药 物 测 试 、 细 胞 分 化 及 病 毒学 方 面 的 实 验 缺 点 ： 传 代 次 数 较 多 细 胞 就 会 衰 亡 。 传 代 细 胞 培 养 概 念 ： 原 代 细 胞 经 过 一 系 列 传 代 ， 产 生 变异 ， 转 化 为 能 够 连 续 传 代 的 细 胞 。 传 代 细 胞 可 以 直 接 从 肿 瘤 组 织 获 得 ， 又 可以 通 过 人 工 驯 化 获 得 。 常 用 的 传 代 细 胞 ： PK-15、 IBRS-2、 Vero、Marc-145、 CHO、 MDCK、 CRFK、 Hela 等 四 培 养 实 验 用 品 的 前 期 处 理1.清 洗 和 浸 泡 : (1)玻 璃 器 皿 (2)塑 料 器 皿2.包 装3.消 毒 ： 在 组 织 细 胞 培 养 技 术 中 ， 务 必 保证 组 织 细 胞 在 无 微 生 物 的 条 件 下 生 长 。 4.细 胞 培 养 用 液 及 培 养 基 （ 液 ） : （ 1） 水 ： 蒸 馏 水 、 双 蒸 水 ， 可 高 压 除 菌 。（ 2） 平 衡 盐 溶 液 （ PBS)： PH为 7.2 7.4， 不 含 钙 镁 离 子 ， 可 高 压 除 菌 。（ 3） 消 化 液 : 胰 蛋 白 酶 液 ： 常 用 胰 蛋 白 酶 的 浓 度 为 0 25 ， pH值 7.2左右 。 需 过 滤 除 菌 。 EDTA液 ： 常 用 浓 度 为 0 02 ， 配 制 时 采 用 无 Ca 2+、Mg2+平 衡 盐 液 溶 解 ， 高 压 灭 菌 后 即 可 使 用 。 (4) 培 养 基 培 养 基 （ 培 养 液 ） 是 维 持 体 外 细 胞 生 存 和 生 长 的溶 液 ， 分 天 然 培 养 基 和 合 成 培 养 基 。 天 然 培 养 基 ： 天 然 培 养 基 有 血 清 、 血 浆 、 和 组 织 提 取 液 （ 如 鸡胚 和 牛 胚 浸 液 ） 。 优 点 ： 营 养 成 分 丰 富 ， 培 养 效 果 好 缺 点 ： 来 源 受 限 。 成 分 复 杂 ， 影 响 对 某 些 实 验 产物 的 提 取 和 实 验 结 果 的 分 析 ， 易 发 生 支 原 体 污 染 合 成 培 养 基 合 成 培 养 基 是 根 据 细 胞 生 存 所 需 物 质 的 种 类 和 数量 ， 用 人 工 方 法 模 拟 合 成 的 。 目 前 已 设 计 出 许 多种 培 养 基 ， 如 TC199、 MEM、 RPMI-1640、 DMEM等 。 合 成 培 养 基 主 要 成 分 是 氨 基 酸 、 维 生 素 、 碳 水 化合 物 、 无 机 盐 和 其 它 一 些 辅 助 物 质 。 优 点 ： 标 准 化 生 产 ， 组 分 和 含 量 相 对 固 定 。 成 本低 缺 点 ： 缺 少 某 些 成 分 ， 不 能 完 全 满 足 体 外 细 胞 生长 需 要 。 人 工 合 成 培 养 基 只 能 维 持 细 胞 生 存 ， 要 想使 细 胞 生 长 和 繁 殖 ， 还 需 补 充 一 定 量 的 天然 培 养 基 （ 如 血 清 ） 。 血 清 中 含 有 ： 多 种 蛋 白 质 （ 白 蛋 白 、 球 蛋 白 、 铁 蛋 白 等 ） 多 种 金 属 离 子 激 素 促 贴 附 物 质 ， 如 纤 粘 蛋 白 、 冷 析 球 蛋 白 、 胶 原等 。 各 种 生 长 因 子 转 移 蛋 白 不 明 成 分 一 般 说 来 含 5 小 牛 血 清 的 培 养 基 对 大 多 数 细 胞可 以 维 持 细 胞 不 死 但 支 持 细 胞 生 长 一 般 需 加 10 血 清 对 于 血 清 支 持 细 胞 生 长 的 生 物 学 效 应 已 得 到 证 明 ，但 对 血 清 中 的 复 杂 成 分 至 今 尚 未 完 全 清 楚 血 清 质 量 好 坏 是 实 验 成 败 的 关 键 。 常 用 血 清 有 胎 牛 血 清 、 新 生 牛 血 清 、 小 牛 血 情 、兔 血 清 、 马 血 清 等 ， 其 中 以 胎 牛 血 清 质 量 最 好 。 优 质 血 清 的 标 准 ： 透 明 ， 淡 黄 色 ， 无 沉 淀 物 ， 无细 菌 、 支 原 体 、 病 毒 污 染 。 血 清 的 灭 活 （ 消 除 补 体 活 性 ） ： 56 ， 30 分 钟 （ 5） 丙 酮 酸 钠 、 葡 萄 糖 ： 是 属 碳 水 化 合 物 的 成 分 ， 是 细胞 生 命 的 能 量 来 源 。（ 6） 抗 生 素 ： 最 终 浓 度 为 青 霉 素 100 U ml， 链 霉 素100U ml（ 青 霉 素 为 80万 U 瓶 ， 将 其 溶 解 于 4ml三 蒸水 中 ， 每 升 培 养 液 中 加 人 0.5ml； 链 霉 素 为 100万 U 瓶 ，将 其 溶 解 在 5ml三 蒸 水 中 ， 每 升 培 养 液 加 0.5ml） 。（ 7） 冻 存 液 ： 二 甲 基 亚 砜（ 8） 细 胞 生 长 液 ： 是 用 以 维 持 细 胞 生 长 增 殖 的 液 体 。其 是 配 方 ： 基 础 培 养 基 80 90 血 清 10% 双 抗 100u/ml （ 9） 细 胞 维 持 液 ： 用 以 维 持 细 胞 缓 慢 生 长 或 不 死 的 培 养液 。其 是 配 方 ： 基 础 培 养 基 95 血 清 2 5 双 抗 100u/ml 五 培 养 细 胞 的 生 长 方 式 及 类 型 贴 附 生 长 型 细 胞 必 须 贴 附 于 底 物 才 能 生 长 的 细 胞 。 从 形 态 上 大体 分 为 上 皮 细 胞 型 及 成 纤 维 细 胞 型 ， 还 有 一 些 难以 确 定 其 稳 定 形 态 的 细 胞 。 悬 浮 生 长 型 细 胞 不 需 要 附 着 于 底 物 而 于 悬 浮 状 态 下 即 可 生 长 。 每 代 贴 附 生 长 细 胞 的 生 长 过 程 游 离 期 贴 壁 期 潜 伏 期 对 数 生 长 期 停 止 期 （ 平 台 期 ） 贴 附 生 长 型 细 胞细 胞 培 养 常 用 的 培 养 瓶 、培 养 皿 、 6孔 板 、 96孔 板 悬 浮 生 长 型 细 胞 六 细 胞 培 养 的 实 验 步 骤1原 代 细 胞 的 培 养 以 鸡 胚 成 纤 维 细 胞 为 例 （ 1） 取 胚 （ 2） 组 织 处 理 （ 3） 消 化 （ 4） 分 装 、 培 养 （ 1） 取 胚 选 取 9-11日 龄 SPF鸡 胚 ， 大 头 朝 上 直 立 于 蛋架 上 ， 用 碘 酒 、 酒 精 消 毒 气 室 外 壳 。 用 镊子 从 气 室 端 打 开 蛋 壳 ， 撕 开 壳 膜 ， 用 无 菌镊 子 轻 轻 取 出 鸡 胚 ， 放 入 灭 菌 平 皿 中 。 （ 2） 组 织 处 理 用 PBS液 冲 洗 胚 体 2-3次 ， 再 将 鸡 胚 的 头 、爪 、 内 脏 去 除 ， 剩 下 的 胚 体 在 用 PBS液 冲洗 胚 体 2-3次 ， 然 后 再 放 入 平 皿 中 ， 用 剪 刀将 鸡 胚 剪 成 碎 块 。 （ 3） 消 化 用 PBS液 充 分 冲 洗 组 织 碎 块 2-3次 ， 加 入 3-5倍 量 的 胰 蛋 白 酶 消 化 液 ， 置 37 消 化 10分钟 ， 每 隔 2-3分 钟 轻 轻 摇 动 一 次 。 待 组 织 碎块 聚 合 成 团 ， 边 缘 毛 样 模 糊 时 取 出 ， 轻 轻吸 取 上 层 消 化 液 ， 加 适 量 DMEM培 养 液 ，用 吸 管 反 复 吹 打 ， 使 细 胞 分 散 。 （ 4） 分 装 、 培 养 将 细 胞 悬 液 移 入 细 胞 培 养 瓶 中 ， 在 细 胞 培养 瓶 中 加 入 到 10ml DMEM， 充 分 混 匀 ， 让细 胞 呈 单 个 形 式 存 在 ， 最 后 将 其 放 入 恒 温箱 中 培 养 。 2传 代 细 胞 的 培 养 （ 1） 细 胞 的 复 苏 （ 2） 细 胞 的 传 代 （ 3） 细 胞 的 换 液 （ 4） 细 胞 生 长 状 况 的 观 察 （ 5） 细 胞 的 冻 存 （ 1） 细 胞 的 复 苏概 述 复 苏 细 胞 与 冻 存 的 要 求 相 反 ， 应 采 用 快 速融 化 的 手 段 。 这 样 可 以 保 证 细 胞 外 结 晶 在 很 短 的时 间 内 即 融 化 。 避 免 由 于 缓 慢 融 化 使 水 分 渗 入 细胞 内 形 成 胞 内 再 结 晶 对 细 胞 造 成 损 害 。 操 作 步 骤 准 备 好 培 养 瓶 、 培 养 液 和 离 心 管 等 放 于 超 净 工 作 台 内 。 从 保 存 液 氮 或 低 温 冰 箱 中 冻 存 管 （ 安 瓶 ） 的 小 袋 或 冻 存 盒 内 取 出 的冻 存 管 （ 安 瓶 ） 应 直 接 投 入 37 温 水 中 ， 并 轻 轻 摇 动 令 其 内 容 尽 快 融化 。 从 37 水 浴 中 取 出 冻 存 管 或 安 瓶 ， 离 心 1000r 1min,用 酒 精 消 毒后 开 启 ， 用 滴 管 吸 出 上 清 液 ， 注 入 培 养 液 1ml充 分 混 匀 ， 转 入 刻 度 离心 管 制 成 细 胞 悬 液 后 低 速 离 心 ， 除 去 上 清 液 ， 必 要 时 再 重 复 用 培 养 液洗 一 次 。 用 培 养 液 适 当 稀 释 后 ， 接 种 培 养 瓶 ， 放 入 CO 2培 养 箱 静 置 培 养 ，次 日 更 换 一 次 培 养 液 。 继 续 培 养 。 如 果 复 苏 时 细 胞 密 度 较 高 要 及 时 传代 。 细 胞 复 苏 时 细 胞 数 可 以 做 10 20倍 稀 释 ， 接 种 密 度 以 5 105 ml为 宜 。 （ 2） 细 胞 的 传 代原 理 在 培 养 瓶 长 成 致 密 单 层 后 ， 已 基 本 上 饱 和 （ 细 胞 增 值达 到 一 定 密 度 后 ） ， 为 使 细 胞 能 继 续 生 长 ， 同 时 也 将 细 胞数 量 扩 大 ， 就 必 须 进 行 传 代 （ 再 养 ） 。 传 代 培 养 也 是 一 种将 细 胞 种 保 存 下 去 的 方 法 。 同 时 也 是 利 用 培 养 细 胞 进 行 各种 实 验 的 必 经 过 程 。 悬 浮 型 细 胞 直 接 分 瓶 就 可 以 ， 而 贴 壁细 胞 需 经 消 化 后 才 能 分 瓶 。 操 作 步 骤 将 长 满 细 胞 的 培 养 瓶 中 原 来 的 培 养 液 弃 去 。 用 1-2ml营 养 液 或 PBS缓 冲 液 ， 清 洗 培 养 瓶 ， 倒 出 加 入 1ml含 有 EDTA的 胰 酶 ， 清 洗 五 面 ， 倒 出 在 加 入 1ml含 有 EDTA的 胰 酶 ， 当 看 到 培 养 瓶 上 含 有一 两 个 小 空 斑 ， 也 可 看 到 有 灰 白 色 浑 浊 时 ， 将 胰 酶 倒 掉 加 入 培 养 液 ， 用 移 液 管 吹 洗 贴 有 细 胞 的 一 面 ， 将 细胞 从 培 养 瓶 壁 上 吹 下 来 然 后 进 行 传 代 消 化 传 代 的 步 骤 （ 3） 细 胞 的 换 液 原 理 ： 当 细 胞 的 量 很 少 ， 未 能 铺 满 整 个 生 长 表面 ， 但 细 胞 培 养 液 的 pH值 已 经 发 生 很 大 变化 ； 或 者 是 细 胞 形 态 很 差 等 情 况 时 ， 需 要给 细 胞 换 液 。 操 作 步 骤 （ 1） 吸 弃 或 倒 掉 培 养 瓶 内 的 旧 培养 液 （ 2） 加 入 PBS溶 液 清 洗 细 胞 瓶 五面 （ 3） 加 入 足 量 的 细 胞 生 长 液 ， 放入 37 、 5%CO2培 养 箱 静 置 培 养 。 （ 4） 细 胞 生 长 状 况 的 观 察 原 理 ： 应 每 日 或 隔 日 观 察 一 次 细 胞 ， 及 时 了解 细 胞 形 态 、 数 量 及 培 养 液 pH值 、 污 染 与否 等 情 况 ， 以 便 采 取 相 应 的 措 施 处 理 。 肉 眼 观 察 显 微 镜 观 察 （ 5） 细 胞 的 冻 存 传 代 细 胞 应 有 充 足 的 冻 存 储 备 。 一 则 防 止 细 胞 因 污 染 等 原 因 造 成 细 胞 系 的绝 种 。 二 则 防 止 细 胞 因 传 的 代 次 太 多 ， 造 成 细 胞衰 老 或 细 胞 发 生 变 异 。 细 胞 冻 存 方 法 （ 1） 选 取 对 数 生 长 期 的 细 胞 ， 用 常 规 传 代 的 方 法将 细 胞 制 成 悬 液 并 计 数 ， 800-1000r/min离 心 5min，弃 上 清 。 （ 2） 用 细 胞 冻 存 液 将 沉 淀 重 悬 ， 调 整 细 胞 浓 度 至106-107个 /ml， 分 装 于 冻 存 管 ， 注 明 细 胞 名 称 ， 传代 及 冻 存 日 期 。 （ 3） 冷 冻 保 存 ： 将 冻 存 管 于 4 放 置 30min， 然后 移 入 -80 超 低 温 冰 箱 过 夜 ， 再 放 入 液 氮 罐 长 期保 存 。 亦 可 使 用 程 序 降 温 剂 逐 渐 降 温 ， 冻 存 速 度先 为 每 分 钟 下 降 速 度 1-2 ， 当 温 度 达 到 -25 时 ，可 调 整 下 降 速 度 为 每 分 钟 5-10 ， 温 度 降 至 -100 时 ， 再 放 入 液 氮 罐 中 长 期 保 存 。 七 病 毒 的 细 胞 培 养 以 禽 流 感 感 染 鸡 胚 成 纤 维 细 胞 为 例 。 （ 1） 病 料 的 处 理 （ 2） 病 毒 分 离 、 繁 殖 （ 3） 细 胞 病 变 的 观 察 （ 4） 效 价 测 定 （ 5） 中 和 实 验 （ 1） 病 料 的 处 理 采 集 疑 是 感 染 禽 流 感 禽 的 心 、 脑 、 肺 、淋 巴 结 在 含 有 双 抗 的 PBS液 中 研 磨 ， 4 过夜 ， 3000r/min离 心 10min， 上 清 通 过0.22m抽 滤 （ 2） 病 毒 分 离 、 繁 殖 1 将 病 毒 液 稀 释 成 多 个 浓 度 分 别 接 种 在 鸡 胚 中 ， 鸡 胚 死 亡后 收 集 尿 囊 液 。 取 效 价 最 高 的 尿 囊 液 接 种 细 胞 。 2 将 长 成 单 层 致 密 的 鸡 胚 成 纤 维 细 胞 液 倒 掉 ， 用 PBS反 复清 洗 3次 ， 将 死 亡 或 脱 落 的 细 胞 洗 掉 3 取 0.5ml处 理 好 的 禽 流 感 病 毒 液 注 入 细 胞 瓶 内 ， 使 病 毒液 充 分 铺 满 瓶 底 4 将 接 种 病 毒 后 的 细 胞 瓶 置 于 培 养 箱 中 感 作 45 min， 将 感 作 后 的 细 胞 瓶 补 加 4.5ml营 养 液 后 置 于温 箱 中 培 养 5 12h后 观 察 细 胞 病 变 ， 若 无 明 显 病 变 ， 则 每 隔 3h观 察 一 次 。 当 有 70%细 胞 发 生 病 变 后 ， 将 细 胞 液反 复 冻 融 3次 ， 用 吸 管 反 复 吹 打 数 次 ， 使 病 毒 完 全从 细 胞 中 释 放 出 来 正 常 形 态 的 鸡 胚 成 纤 维 细 胞 接 毒 后 发 生 病 变 的 鸡 胚 成 纤 维 细 胞 （ 4） 效 价 测 定 某 些 病 毒 具 有 凝 集 某 种 哺 乳 动 物 红 细 胞的 特 性 ， 利 用 该 特 性 而 进 行 的 试 验 称 为 病毒 的 血 凝 试 验 。