微波辅助萃取气相色谱质谱联用分析石蒜中的加兰他敏

微 波 辅 助 萃 取 气 相 色 谱 质 谱 联 用 分 析 石 蒜 中 的 加 兰 他 敏 指 导 老 师 ： 李 攻 科 教 授报 告 人 ： 汪 军 霞 1. 前 言 u 前 苏 联 科 学 家 首 次 分 离 出 了 加 兰 他 敏 。u 加 兰 他 敏 是 一 种 具 有 可 逆 性 和 选 择 性 的乙 酰 胆 碱 酯 酶 抑 制 剂 （ AChE） ， 可 以作 为 治 疗 AD的 药 物 。 1.1 加 兰 他 敏 及 其 氢 溴 酸 盐 的 化 学 性 质 和 组 成分 子 式 ： C17H 21NO3 分 子 量 ： 287.36化 学 名 称 ：4a,5,9,10,11,12-H exahydro-3-methoxy-11-methyl-6H -benzofuro3a,3,2-ef2benzazepin-6-ol 1.2 分 析 研 究 现 状u 药 理 作 用 研 究 概 况u 加 兰 他 敏 的 传 统 提 取 方 法u 加 兰 他 敏 的 分 析 检 测 方 法 1.2.1 药 理 作 用 研 究 概 况u 重 症 肌 无 力u 脊 髓 前 角 灰 质 炎 （ 小 儿 麻 痹 症 ） 后 遗 症u 术 后 肠 肌 麻 痹u 尿 潴 留 u 解 箭 毒u 阿 尔 茨 海 默 病 1.2.1.1 药 理 作 用 特 点u 具 有 可 逆 性 和 选 择 性 的 乙 酰 胆 碱 酯 酶 抑制 剂 （ AChE）u 作 用 时 间 长u 无 毒 性 或 致 癌 作 用u 耐 受 性 好 1.2.2 加 兰 他 敏 的 传 统 提 取 方 法 概 述u 传 统 生 产 工 艺 ： 将 石 蒜 通 过 乙 醇 热 提 ， 洗涤 ， 萃 取 ， 重 结 晶 ， 得 到 氢 溴 酸 加 兰 他 敏原 料 药 。u 缺 点 ： 能 耗 高 、 原 辅 料 损 耗 大 、 生 产 周 期 长 ， 而 且 加 兰 他 敏 提 取 不 完 全 。 1.2.3 加 兰 他 敏 的 分 析 检 测 方 法 综 述u 薄 层 色 谱 （ TLC）u 高 效 液 相 色 谱 （ H PLC） u 气 相 色 谱 法 （ G C） u 免 疫 分 析 法 （ IA） u 高 效 毛 细 管 电 泳 （ H PCE）u 联 用 方 法 1.3 微 波 辅 助 萃 取 技 术u 微 波 辅 助 萃 取 原 理u 微 波 辅 助 萃 取 特 点u 微 波 辅 助 萃 取 系 统u MAE在 植 物 提 取 中 的 应 用 1.3.1 微 波 辅 助 萃 取 原 理 u 微 波 加 热 有 两 种 机 理 ： 离 子 传 导 和 偶 极子 转 动 。u 物 质 吸 收 微 波 的 程 度 主 要 取 决 于 其 介 电常 数 ， 被 萃 取 物 质 进 入 介 电 常 数 小 ， 微波 吸 收 能 力 相 对 较 差 的 萃 取 剂 中 。 1.3.2 微 波 辅 助 萃 取 特 点u 升 温 速 度 快u 加 热 均 匀u 选 择 性 好u 萃 取 效 率 高u 伴 有 生 物 效 应 1.3.3 微 波 辅 助 萃 取 系 统 高 压 密 闭 微 波 萃 取 系 统 ：u 磁 控 管u 波 导 管u 微 波 腔u 波 形 搅 拌 器u 循 环 装 置u 转 台 1.3.4 MAE在 植 物 提 取 中 的 应 用 u 最 早 的 报 道 来 自 1986年 ， 匈 牙 利 学 者 Ganzler K用 微 波 提 取 了 羽 扇 豆 、 玉 米 等 作 物 中 的 油 脂 、棉 籽 酚 等 有 效 成 分 。u 国 内 外 已 有 很 多 将 MAE应 用 于 中 药 中 有 效 成分 提 取 的 文 献 报 道 。u 本 实 验 室 的 研 究 人 员 在 这 方 面 也 做 了 大 量 的工 作 。 2 实 验 部 分u 仪 器 及 操 作 条 件u 试 剂 和 样 品u 样 品 处 理 过 程u 定 性 和 定 量 2.1 仪 器 及 操 作 条 件 仪 器u Mars 型 微 波 炉 （ CEM， USA） ；u R201旋 转 蒸 发 仪 （ 上 海 申 科 机 械 研 究 所 ） ；u H P-6890G C-5973MSD配 G 1701B.02.05工 作 站（ H ewlett-Packard， USA） ;u DB-5MS熔 融 毛 细 管 柱 （ J&W， CA） 。 操 作 条 件u 色 谱 条 件 ： 升 温 程 序 初 温 150 ， 保 持 3 min， 以 6 / min的 速 度 升 至 300 ，保 持 5 min。 进 样 口 温 度 250 ， 不 分 流进 样 。 载 气 为 高 纯 氦 气 ， 流 速 1.0 mL / min。u 质 谱 条 件 ： 接 口 温 度 280 ， EI， 电 子能 量 70 eV， 离 子 源 温 度 230 ， 四 极 杆温 度 150 ， 质 量 扫 描 范 围 50 550 amu。 2.2 试 剂 和 样 品u 氢 溴 酸 加 兰 他 敏 标 准 品 购 自 Sigma公 司 。u 甲 醇 、 乙 醇 、 石 油 醚 （ 沸 程 ： 90 120 ） 、 乙 醚 、 丙 酮 、 乙 酸 乙 酯 、 盐 酸 、浓 氨 水 、 碳 酸 钠 （ 分 析 纯 试 剂 ， 广 州 化学 试 剂 厂 ） 。u 石 蒜 ： 鳞 茎 棕 黑 色 片 状 物 ， 有 特 殊 香 味 。 2.3 样 品 处 理 过 程u 前 处 理 ： 粉 碎 ， 过 筛 ， 储 存 在 干 燥 器 中 。u 微 波 辅 助 萃 取 ： 定 量 称 取 样 品 放 入 微 波罐 中 ， 加 入 一 定 体 积 的 萃 取 溶 剂 ， 在 一定 的 控 制 温 度 下 萃 取 一 定 的 时 间 。 取 出萃 取 液 ， 过 滤 ， 滤 液 旋 干 后 甲 醇 溶 解 ，定 容 至 5 mL。 u 乙 醇 加 热 回 流 萃 取 ： 准 确 称 取 1 g石 蒜样 品 ， 放 入 圆 底 烧 瓶 中 ， 加 入 一 定 体 积的 萃 取 溶 剂 ， 水 浴 加 热 回 流 2 h后 ， 冷却 过 滤 ， 再 旋 转 蒸 发 至 近 干 ， 用 甲 醇 定容 至 5 mL， 取 1 L用 GC-MS测 定 。 2.4 定 性 和 定 量 采 用 未 经 衍 生 化 的 G C-MS方 法 进 行 定 性 ， 以 峰 面 积定 量 ， 不 分 流 进 样 ， 进 样 量 1 L。 图 一 加 兰 他 敏 甲 醇 标 准 溶 液 色 谱 图4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.000200000400000600000800000100000012000001400000160000018000002000000220000024000002600000280000030000003200000340000036000003800000Time-Abundance TIC: 0114S01.D 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.000200000400000600000800000100000012000001400000160000018000002000000220000024000002600000 2800000300000032000003400000360000038000004000000 Time- Abundance TIC: 0115Y3MP.D 21 图 二 石 蒜 样 品 的 甲 醇 溶 液 色 谱 图 （ 标 记 为 1的 是 加 兰 他 敏 的 峰 ） 3 结 果 与 讨 论u 微 波 萃 取 溶 剂 的 选 择u 微 波 条 件 的 优 化u 微 波 辅 助 萃 取 方 法 的 线 性 范 围 、 检 出 限 、回 收 率 和 精 密 度u 和 传 统 方 法 的 对 比 3.1 微 波 萃 取 溶 剂 的 选 择u 正 确 选 择 萃 取 溶 剂 是 实 现 高 效 率 萃 取 的 关 键 步 骤 。u MAE中 ， 所 选 的 溶 剂 应 满 足 以 下 条 件 ： 1 具 有 吸 收 微 波 及 将 微 波 转 化 为 热 能 的 能 力 ； 2 能 够 选 择 性 的 从 样 品 基 体 中 将 待 测 物 分 离 萃 取 出 来 ； 3 方 便 于 后 续 处 理 过 程 。 表 1 不 同 溶 剂 萃 取 效 率 的 比 较 溶 剂 甲 醇 乙 醇 丙 酮 乙 酸 乙 酯加 兰 他 敏的 含 量 0.0232 0.0064 3.2微 波 条 件 的 优 化 实 验 号 颗 粒 度/mesh 溶 剂 体 积/ml 辐 射 温 度/ C 辐 射 时 间 /min 峰 面 积 相 对 峰 面 积 1 2040 10 65 5 11906302 36.8 2 2040 20 75 15 21394576 66.1 3 2040 30 85 25 27012145 83.5 4 4060 10 75 25 22631878 69.9 5 4060 20 85 5 32366940 100 6 4060 30 65 15 31475106 97.2 7 60 10 85 15 18904841 58.4 8 60 20 65 25 21981459 67.9 9 60 30 75 5 25350629 78.3表 2 微 波 萃 取 条 件 的 正 交 实 验 设 计 及 峰 面 积 结 果 （ OAD9(43)） 表 3 各 因 素 不 同 水 平 对 应 的 峰 面 积 之 和 及 平 均 值 （ % ）注 ： Ki峰 面 积 之 和 ； ki峰 面 积 平 均 值 。 颗 粒 度 mesh 溶 剂 体 积 mL 辐 射 温 度 辐 射 时 间 minK1 60313023 53443021 65362867 69623871K2 86473924 75742975 69377083 71774523K3 66236929 83837880 78283926 71625482k1 20104341 17814340 21787622 23207957k2 28824641 25247658 23125694 23924841k3 22078976 27945960 26094642 23875161 图 三 颗 粒 度 、 溶 剂 体 积 、 控 制 温 度 、 辐 射 时 间 于 萃 取 效 率 的 影 响 0.00E+00 1.00E+07 2.00E+07 3.00E+07 4.00E+07 5.00E+07 6.00E+07 7.00E+07 8.00E+07 9.00E+07 回 收 率 颗 粒 度 溶 剂 体 积 辐 射 温 度 辐 射 时 间 影 响 因 素 水 平 1 水 平 2 水 平 3 表 4 优 化 的 微 波 萃 取 条 件 颗 粒 度 mesh 溶 剂 体 积 mL 辐 射 温 度 辐 射 时 间 min 4060 20 85 5 3.3 微 波 辅 助 萃 取 方 法 的 线 性 范 围 、检 出 限 、 回 收 率 和 精 密 度 表 5 线 性 范 围 、 检 出 限 、 回 收 率 和 精 密 度线 性 方 程 Y=3.3048E5X 1.2784E7线 性 相 关 系 数 R 0.9996线 性 范 围 10 100 mgL-1检 出 限 3.42 mgL-1回 收 率 99.3 %RSD 7.9 %(n=6) 3.4 和 传 统 方 法 的 对 比 表 6 微 波 萃 取 法 与 乙 醇 加 热 回 流 萃 取 法 测 定加 兰 他 敏 的 结 果 比 较 加 兰 他 敏 的 含 量/ mgL-1 RSD/%(n=6) 萃 取 时 间/min微 波 萃 取 法 96.6 4.4 5 乙 醇 加 热 回流 萃 取 法 99.4 9.9 120 4. 结 论 本 实 验 建 立 了 MAE GC MS分 析 石 蒜 中 加 兰他 敏 的 方 法 ， 并 且 利 用 正 交 设 计 实 验 优 化 了微 波 萃 取 测 定 石 蒜 样 品 中 加 兰 他 敏 的 条 件 ,方法 平 均 回 收 率 99.3 %， 检 出 限 3.42 mgL-1，RSD = 4.4 %， 线 性 范 围 10 100 mgL-1。 将本 方 法 与 乙 醇 加 热 回 流 提 取 法 相 比 ， 结 果 表明 本 方 法 省 时 、 精 密 度 好 、 操 作 简 便 ， 适 合于 石 蒜 中 加 兰 他 敏 的 快 速 测 定 。 致 谢 u 在 本 论 文 的 研 究 工 作 和 写 作 过 程 中 ， 得 到 了 许 多 人 的指 导 、 关 心 和 帮 助 。u 首 先 ， 要 衷 心 感 谢 我 的 导 师 李 攻 科 教 授 ， 感 谢 她 对 我认 真 严 谨 的 悉 心 指 导 和 无 微 不 至 的 关 怀 。 u 在 整 个 论 文 设 计 和 操 作 过 程 中 ， 栾 伟 师 兄 给 予 极 大 的支 持 和 帮 助 ， 从 他 身 上 我 学 到 了 大 量 的 知 识 和 科 学 的研 究 方 法 ； 实 验 室 的 许 多 老 师 和 同 学 也 给 予 了 我 大 量帮 助 和 有 益 指 点 。u 特 此 鸣 谢 中 山 大 学 化 学 与 化 学 工 程 学 院 综 合 化 学 实 验创 新 研 究 基 金 的 资 助 ！ 谢 谢