实验四微生物菌落的观察和细菌的运动观察

实 验 四 微 生 物 菌 落 的 观察 和 细 菌 的 运 动 性 观 察 目 的 要 求n 学 会 观 察 、 识 别 各 种 不 同 的 微 生 物 菌 落 的 方 法 。 n 掌 握 平 板 菌 落 计 数 的 方 法 ， 运 用 所 学 的 知 识 详 细 的描 述 所 分 离 平 板 上 的 各 种 微 生 物 菌 落 。n 了 解 普 通 光 学 显 微 镜 的 构 造 和 原 理 ， 熟 悉 其 使 用 的正 确 方 法 。 n 学 习 并 掌 握 油 镜 的 使 用 方 法 ， 学 会 用 压 滴 法 或 悬 滴法 观 察 细 菌 运 动 性 的 基 本 技 术 。 实 验 原 理 对 于 一 些 难 区 别 的 菌 落 还 应 该 借 助 显 微 镜 来 观 察 其 细 胞 形 态 以 进 一 步 做出 正 确 的 判 断 。 微 生 物 类 别菌 落 特 征 单 细 胞 微 生 物 菌 丝 状 微 生 物细 菌 酵 母 菌 放 线 菌 霉 菌主 要特 征 细胞 形 态 特 征 小 而 均 匀个 别 有 芽 孢 大 而 分 化 细 而 均 匀 粗 而 分 化相 互 关 系 单 个 分 散 或 按一 定 方 式 排 列 单 个 分 散 或假 丝 状 丝 状 交 织 丝 状 交 织菌落 含 水 情 况 很 湿 或 较 湿 较 湿 干 燥 或 较 干 燥 干 燥外 观 特 征 小 而 突 起或 大 而 平 坦 大 而 突 起 小 而 紧 密 大 而 疏 松或 大 而 致 密 参 考特 征 菌 落 透 明 度 透 明 或 稍 透 明 稍 透 明 不 透 明 不 透 明菌 落 与 培 养 基 结 合 度 不 结 合 不 结 合 牢 固 结 合 较 牢 固 结 合菌 落 的 颜 色 多 样 单 调 十 分 多 样 十 分 多 样菌 落 正 反 面 颜 色 差 别 相 同 相 同 一 般 不 同 一 般 不 同细 胞 生 长 速 度 一 般 很 快 较 快 慢 一 般 较 快气 味 一 般 有 臭 味 多 带 酒 香 常 有 泥 腥 味 霉 味 （ 一 ） 普 通 光 学 显 微镜 的 构 造 ： 1、 机 械 部 分 ： 镜 臂 、 镜座 、 粗 调 节 器 、 细 调 节器 、 聚 光 升 降 螺 旋 、 载物 台 等 。 -支 持 、 调 节 、固 定 等 作 用 2、 光 学 系 统 ： 接 物 镜 、接 目 镜 、 照 明 装 置 、 聚光 器 等 。1. 物 镜 转 换 器 2. 接 物 镜 3.游 标 卡 尺 4.载 物 台 5.聚 光 器 6. 彩虹 光 阑 7.光 源 8. 镜 座 9. 电 源 开 关 10. 光 源 滑 动 变 阻 器 11. 粗 调 螺 旋 12. 微 调 螺 旋 13. 镜 臂 14.镜 筒 15.目 镜 16.标本 移 动 螺 旋 显 微 镜 的 放 大 倍 数 和 分辨 率 1. 放 大 倍 数 =接 物 镜 放大 倍 数 接 目 镜 放 大 倍数 2. 显 微 镜 的 分 辨 率 是表 示 显 微 镜 辨 析 物 体 （两 端 ） 两 点 之 间 距 离 的能 力 。 n D： 物 镜 分 辨 出 物 体 两 点 间 的 最 短 距 离 ； NA， 数 值 孔 径 ， 是 物 镜 的 参 数 之 一 ； ： 入 射 光 的 波 长 （ 可 见 光 平 均 0.55m) n: 物 镜 和 被 检 标 本 间 介 质 的 折 射 率 ；（ 空 气 为 1.0， 水 为 1.33， 玻 璃 为 1.5， 甘 油 为1.47， 香 柏 油 为 1.52。 ） ： 镜 口 角 （ 即 入 射 角 ） ： 是 指 从 物 镜 光轴 上 的 物 点 发 出 的 光 线 与 物 镜 前 透 镜 有 效 直径 的 边 缘 所 张 的 角 度 。 n 比 如 ， 肉 眼 所 能 感 受 的 光 波 平 均 长 度 为 0.55m， 假 如 NA=0.65的 接 物镜 ， 它 的 分 辨 力 D=*0.55/0.65=0.42m以 下 的 两 点 间 的 距 离 就 分 辨 不出 来 了 ， 即 使 使 用 倍 数 更 大 的 接 目 镜 使 其 总 放 大 率 增 加 也 仍 分 辨 不 出 ，只 有 改 用 数 值 孔 径 更 大 的 接 物 镜 才 行 。 n 显 微 镜 的 分 辨 率 可 用 公 式 表 示 为 ： D=/2NA =/2nsin(/2 ) （ 二 ） 油 镜 的 使 用 原 理n 油 镜 ， 即 油 浸 接 物 镜 。 当光 线 由 反 光 镜 通 过 玻 片 与镜 头 之 间 的 空 气 时 ， 由 于空 气 与 玻 片 的 密 度 不 同 ，使 光 线 受 到 曲 折 ， 发 生 散射 ， 降 低 了 视 野 的 照 明 度 。 n 加 入 中 间 的 介 质 是 一 层 香柏 油 （ 其 折 射 率 与 玻 片 的相 近 ） ， 则 几 乎 不 发 生 折射 ， 增 加 了 视 野 的 进 光 量 ，从 而 使 物 象 更 加 清 晰 。 实 验 材 料n 实 验 三 所 作 的 平 板 培 养 物 ：q A， 在 细 菌 培 养 基 上 生 长 的 各 种 菌 落 ；q B， 在 霉 菌 培 养 基 上 生 长 的 各 种 菌 落 。 n 实 验 二 所 作 的 试 管 斜 面 ， 酒 精 灯 、 接 种 环 等 。n 盖 玻 片 、 凹 玻 片 、 接 种 环 、 酒 精 灯 。n 菌 种 ： 大 肠 杆 菌 E.coli， 枯 草 杆 菌 B.subtilis或 实 验 三 所培 养 菌 种 实 验 程 序 （ 观 察 描 述 菌 落 特 征 ）n 运 用 所 掌 握 的 各 种 微 生 物 菌 落 的 特 点 ， 观 察 、 识 别 、 描 述 所做 样 品 的 两 个 平 板 上 的 所 有 菌 落 ,并 将 结 果 填 入 表 1中 。n 常 用 的 菌 落 描 述 词 语 ：n 大 小 ： 大 、 中 、 小 、 针 尖 状n 形 状 ： 圆 形 、 隆 起 、 扁 平 、 假 根 状 、 不 规 则 状 等 ； n 边 缘 情 况 ： 整 齐 、 波 形 、 裂 叶 状 、 锯 齿 状 等n 表 面 情 况 ： 干 燥 、 湿 润 、 光 滑 、 皱 褶 、 颗 粒 状 、 龟 裂 状等 ； 样 品来 源 培 养 基类 型 菌 落 类型 特 征 描 述 菌 落 数（ 近 似 值 ）大 小 形 状 颜 色 表 面 情 况 边 缘 情 况 A 1A 2B 3B 4 A 1A 2B 3B 4 表 1 平 板 菌 落 特 征 描 述 n 定 义 :根 据 微 生 物 在 固 体 培 养 基 上 所 形 成 的 单 个 菌 落是 由 一 个 单 细 胞 繁 殖 而 成 这 一 培 养 特 征 而 设 计 的 计 数方 法 ， 即 一 个 菌 落 代 表 一 个 单 细 胞 。 统 计 菌 落 数 目 ，即 可 计 算 出 样 品 中 的 含 菌 数 。n 此 法 所 计 算 的 菌 数 是 培 养 基 上 长 出 来 的 菌 落 数 ， 故 又称 活 菌 计 数 。 n 对 土 壤 中 的 微 生 物 进 行 计 数 ,将 结 果 填 入 表 2中 。实 验 程 序 （ 平 板 菌 落 计 数 ） 表 2 土 壤 中 微 生 物 计 数 结 果 稀 释 度 10-5 10-6 1g样 品 活 菌 数1 2 平 均 1 2 平 均细 菌 菌 落数霉 菌 菌 落数 计 数 方 法 : 每 克 土 壤 的 菌 数 =同 一 稀 释 度 几 次 重 复 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 计 算 结 果 时 ， 常 按 下 列 标 准 从 接 种 后 的 2个 或 3个 稀 释 度 中 选 择 一 个 合 适 的 稀释 度 ， 求 出 每 克 菌 剂 中 的 含 菌 数 。 （ 1） 同 一 稀 释 度 各 个 重 复 的 菌 数 相 差 不 太 悬 殊 。 （ 2） 细 菌 、 放 线 菌 、 酵 母 菌 以 每 皿 30300个 菌 落 为 宜 ， 霉 菌 以 每 皿 10100个 菌 落 为 宜 。选 择 好 计 数 的 稀 释 度 后 ， 即 可 统 计 在 平 板 上 长 出 的 菌 落 数 ， 统 计 结 果 按 下 式计 算 。 实 验 程 序 显 微 镜 （ 油 镜 ） 的 使 用 ： 1、 用 前 检 查 ： 零 件 是 否 齐 全 ， 镜 头 是 否 清 洁 。 2、 打 开 光 源 ， 调 节 光 亮 度 3、 低 倍 镜 观 察 ： 粗 调 、 细 调 4、 依 次 再 进 行 中 倍 、 高 倍 观 察 5、 油 镜 观 察 ： 高 倍 镜 下 找 到 清 晰 的 物 象 后 ， 提 升 聚 光 镜 ， 在 标 本 中 央滴 一 滴 香 柏 油 ， 使 油 镜 镜 头 浸 入 香 柏 油 中 ， 细 调 至 看 清 物 象 为 止 。 6、 换 片 ： 另 换 新 片 ， 必 须 从 第 三 条 开 始 操 作 。 7、 用 后 复 原 ： 观 察 完 毕 ， 上 悬 镜 筒 ， 先 用 擦 镜 纸 擦 去 镜 头 上 的 油 ， 然后 再 用 擦 镜 纸 沾 取 少 量 二 甲 苯 擦 去 残 留 的 油 ， 最 后 用 擦 镜 纸 擦 去 残 留的 二 甲 苯 ， 后 将 镜 体 全 部 复 原 。一 、 结 合 标 本 片 的 观 察 ， 掌 握 油 镜 的 使 用 方 法 ；观 察 各 类 微 生 物 染 色 片 ， 边 观 察 边 绘 图 。 二 、 细 菌 运 动 性 的 观 察 （ 压 滴 法 ） ：n (1) 制 备 菌 液 ： 从 幼 龄 菌 斜 面 上 ， 挑 数 环 菌 放 在 装 有 1 2mL无菌 水 的 试 管 中 ， 制 成 轻 度 混 浊 的 菌 悬 液 。n (2) 取 2 3环 稀 释 菌 液 于 洁 净 载 玻 片 中 央 ， 再 加 入 一 环 0.01%的美 蓝 水 溶 液 ， 混 匀 。n (3) 用 镊 子 夹 一 洁 净 的 盖 玻 片 ， 先 使 其 一 边 接 触 菌 液 ， 然 后 慢慢 地 放 下 盖 玻 片 ， 这 样 可 防 止 产 生 气 泡 。 n (4) 镜 检 ： 将 光 线 适 当 调 暗 ， 先 用 低 倍 镜 找 到 观 察 部 位 ， 再 用高 倍 镜 观 察 。n 要 区 分 细 菌 鞭 毛 运 动 和 布 朗 运 动 ， 后 者 只 是 在 原 处 左 右 摆 动 ，细 菌 细 胞 间 有 明 显 位 移 者 ， 才 能 判 定 为 有 运 动 性 。 二 、 细 菌 运 动 性 的 观 察 （ 悬 滴 法 ） ：n 1.制 备 菌 液 ： 在 幼 龄 菌 斜 面 上 ， 滴 加 3-4mL无 菌 水 ， 制 成 轻 度 混 浊 的 菌悬 液 。n 2.涂 凡 士 林 ： 取 洁 净 无 油 的 盖 玻 片 1块 ， 在 其 四 周 涂 少 量 的 凡 士 林 （ 或香 柏 油 ） 。n 3.滴 加 菌 液 ： 加 1滴 菌 液 于 盖 玻 片 的 中 央 ， 并 用 记 号 笔 在 菌 液 的 边 缘 做一 记 号 ， 以 便 在 显 微 镜 观 察 时 ， 易 于 寻 找 菌 液 的 位 置 。 n 4.盖 凹 玻 片 将 凹 玻 片 的 凹 槽 对 准 盖玻 片 中 央 的 菌 液 ， 并 轻 轻 地 盖 在 盖玻 片 上 ， 使 两 者 粘 在 一 起 ， 然 后 翻转 凹 玻 片 ， 使 菌 液 正 好 悬 在 凹 槽 的中 央 ， 再 用 铅 笔 或 火 柴 棒 轻 压 盖 玻片 ， 使 玻 片 四 周 边 缘 闭 合 ， 以 防 菌液 干 燥 。n 5.镜 检 先 用 低 倍 镜 找 到 标 记 ， 再 稍微 移 动 凹 玻 片 即 可 找 到 菌 滴 的 边 缘 ，然 后 将 菌 液 移 到 视 野 中 央 换 高 倍 镜观 察 。 n 由 于 菌 体 是 透 明 的 ， 镜 检 时 可 适 当缩 小 光 圈 或 降 低 聚 光 器 以 增 大 反 差 ，便 于 观 察 。n 镜 检 时 要 仔 细 辨 别 是 细 菌 的 运 动 还是 分 子 运 动 （ 即 布 朗 运 动 ） 。 实 验 程 序 （ 无 菌 操 作 技 术 ）在 酒 精 灯 火 焰 旁 操 作 ， 将 所 给 的 两 种 菌 种 无 菌 操作 ， 转 接 到 大 试 管 斜 面 ， 并 贴 标 签 ， 培 养 。点 燃 酒 精 灯左 手 夹 住 两 试 管 ： 斜 面 向 上 ， 45 0度 角 。灼 烧 接 种 环右 手 拔 棉 塞 ， 管 口 过 火取 菌标 记 培 养 n 将 观 察 到 的 菌 落 特 征 填 入 表 1中 。n 将 平 板 菌 落 计 数 的 结 果 填 入 表 2中 。n 斜 面 接 种 要 注 意 那 些 问 题 ？n 分 别 绘 出 高 倍 镜 和 油 镜 下 观 察 到 的 某 细 菌 （ 如 枯草 芽 胞 杆 菌 ） 的 基 本 形 态 。n 油 镜 观 察 时 ， 为 什 么 要 滴 加 香 柏 油 ？ 并 说 明 油镜 观 察 应 注 意 什 么 问 题 ？结 果 与 思 考 题