流感病毒的分离鉴定(二)

实 验 十流 感 病 毒 的 分 离 鉴 定 （ 二 ）1、 血 细 胞 凝 集 实 验2、 血 细 胞 凝 集 抑 制 试 验 目 的 ： 熟 悉 病 毒 血 凝 、 血 凝 抑 制 试 验 的 方 法 及 其 应 用 。 原 理 ： 流 感 病 毒 颗 粒 表 面 有 血 凝 素 ,具 有 使 鸡 、 豚 鼠等 血 细 胞 凝 集 的 能 力 。 把 一 定 浓 度 的 鸡 红 细 胞 加 到 待检 的 鸡 胚 尿 囊 液 或 羊 水 中 ， 如 出 现 血 细 胞 凝 集 现 象 ，即 表 示 有 病 毒 存 在 ； 如 血 凝 阳 性 ， 则 可 进 一 步 用 血 凝抑 制 试 验 进 行 病 毒 鉴 定 ， 流 感 病 毒 的 血 凝 性 ， 可 被 免疫 血 清 中 的 特 异 性 抗 体 所 抑 制 ， 使 其 失 去 凝 集 作 用 ，借 此 可 用 已 知 抗 体 鉴 定 未 知 病 毒 及 病 毒 的 型 、 亚 型 。 实 验 材 料 (1)接 种 流 感 病 毒 的 鸡 胚 。 (2)质 量 分 数 为 0 5 的 鸡 红 细 胞 悬 液 。 (3)流 感 病 毒 型 与 亚 型 免 疫 血 清 。 (4)碘 酒 ， 酒 精 消 毒 棉 球 。 (5)灭 菌 的 镊 子 、 剪 刀 。 (6)无 菌 小 试 管 ， 毛 细 滴 管 ， 吸 管 。 (7)生 理 盐 水 。 (8)试 管 、 试 管 架 。 实 验 方 法 ： 1、 血 细 胞 凝 集 实 验(1)收 获 尿 囊 液 ： 鸡 胚 孵 育 3d后 ,放 4度 冰 箱 过 夜 ,次 日取 出 鸡 胚 ,消 毒 气 室 端 卵 壳 ,用 小 镊 子 在 无 大 血 管 处撕 破 卵 膜 ,以 无 菌 毛 细 管 吸 取 尿 囊 液 ,放 入 无 菌 试 管中 。(2)取 尿 囊 液 0 1mL,作 1： 10稀 释 。 (3)取 10支 小 试 管 ， 按 给 各 管 加 入 生 理 盐 水 0.2mL。(4)取 1： 10稀 释 的 尿 囊 液 0 2mL， 加 人 第 1个 试 管中 ， 混 匀 后 ， 再 吸 出 0 2mL加 入 第 2个 试 管 中 ；混 匀 后 ， 从 第 2个 试 管 吸 出 0 2mL加 入 第 3个 试管 依 次 作 倍 比 稀 释 至 第 九 管 ， 混 匀 后 自 第 9个 试 管 中 取 出 0 2mL弃 掉 。 这 样 各 管 液 体 量 均为 0 2mL， 从 第 1-9个 试 管 的 尿 囊 液 稀 释 度 为1:20， 1:40， ， 1:5120， 第 10个 试 管 为 生 理盐 水 对 照 管 。 (5)稀 释 完 毕 后 加 人 体 积 分 数 为 0 5 的 压 积 鸡 红细 胞 悬 液 ， 每 管 0 2mL,室 温 放 置 3060mn。 流 感 病 毒 血 凝 试 验试 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10生 理 盐 水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2病 毒 液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃 0.2病 毒 稀 释 度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照0.5%鸡 红 细 胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇 匀 置 室 温 60 90分 钟 结 果 + + + + + + + 试 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10生 理 盐 水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2病 毒 液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃 0.2病 毒 稀 释 度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对 照0.5%鸡 红 细 胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇 匀 置 室 温 60 90分 钟结 果 + + + + + + + (6)结 果 观 察观 察 时 要 轻 拿 、 勿 摇 ， 首 先 观 察 对 照 管 应 无 凝 集 ， 然后 再 观 察 试 验 管 ， 各 管 出 现 的 凝 集 程 度 以 “ +”、“ +”、 “ +”、 “ +”、 “ ”表 示 ， 判 断 标 准 如 下 ： “ +”： 全 部 红 细 胞 凝 集 ， 凝 集 的 红 细 胞 铺 满 管 底 ，边 缘 不 整 齐 。 “+”： 大 部 分 红 细 胞 凝 集 ， 在 管 底 铺 成 薄 膜 状 ， 但 尚 有 少 数 红 细 胞 不凝 ， 在 管 底 中 心 形 成 小 红 点 。 “ +”： 约 有 半 数 红 细 胞 凝 集 ， 在 管 底 铺 成 薄 膜 ， 面 积 较 小 ， 不凝 集 的 红 细 胞 在 管 底 中 心 聚 成 小 圆 点 。 “ +”： 只 有 少 数 红 细 胞 凝 集 ， 不 凝 集 的 红 细 胞 在 管 底 中 心 聚 成 小圆 点 ， 凝 集 的 红 细 胞 在 小 圆 点 的 周 围 。 “ ”： 不 凝 集 ， 红 细 胞 沉 于 管 底 ， 呈 一 边 缘 整 齐 的 致 密 圆 点 。 凝 集 效 价 ： 能 使 红 细 胞 呈 “ +”凝 集 的 病 毒 最 高 稀 释度 为 凝 集 效 价 ， 表 示 含 有 一 个 单 位 血 凝 抗 原 。 如 表 ， 第 6个 试 管 为 “ +”， 且 病 毒 稀 释 度 最 高 ， 则 该 病毒 悬 液 效 价 为 1:640， 即 该 病 毒 悬 液 稀 释 到 1： 640时 ， 每0 2mL中 含 有 一 个 血 凝 单 位 ， 配 制 4个 血 凝 单 位 的 病 毒 悬液 时 ， 病 毒 液 应 稀 释 成 (1： 640)X4， 即 1： 160。 2、 血 细 胞 凝 集 抑 制 试 验 试 管 1 待 测 2 待 测 3 血 清 对 照 4 抗 原 对 照 5 红 细 胞 对 照 生 理 盐 水1： 5血 清4u病 毒 液0.5 鸡 红细 胞 0.20.20.2 0.20.20.2 0.20.20.2 0.20.20.2 0.40.2按 表 加 入 材 料 和 试 剂 结 果 观 察先 观 察 3支 对 照 管 ， 如 抗 原 对 照 管 出 现 完 全 凝 集 ， 血 清 对 照 和 红细 胞 对 照 不 发 生 凝 集 ， 再 观 察 试 验 管 。血 凝 抑 制 效 价 ： 完 全 抑 制 红 细 胞 凝 集 的 血 清 最 高 稀 释 度 ， 即 该血 清 的 抑 制 效 价 。鉴 定 病 毒 时 ， 效 价 应 与 原 免 疫 血 清 效 价 相 等 或 相 似 ， 血 凝 抑 制试 验 亦 可 用 已 知 病 毒 抗 原 ， 测 定 病 人 血 清 抗 体 以 进 行 血 清 学 诊断 ， 恢 复 期 比 初 期 抗 体 效 价 增 高 4倍 以 上 才 有 诊 断 意 义 。