高中生物专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段课件新人教版选修

课 题 2 多 聚 酶 链 式 反 应 扩 增 DNA片 段【 课 题 背 景 】在 刑 事 侦 破 案 件 中 常 需 要 对 样 品 DNA进 行 分 析 ， PCR技 术 能 快 速 扩 增DNA片 段 ， 在 几 个 小 时 内 复 制 出 上 百 万 份 的 DNA拷 贝 ， 有 效 地 解 决 了因 为 样 品 中 DNA含 量 太 低 而 难 以 对 样 品 进 行 分 析 研 究 的 问 题 。 现 在PCR技 术 已 广 泛 应 用 于 遗 传 病 的 诊 断 、 刑 侦 破 案 、 古 生 物 学 、 基 因 克隆 和 基 因 测 序 。【 课 题 目 标 】1.理 解 PCR的 原 理 和 反 应 过 程2.尝 试 PCR技 术 的 基 本 操 作3.讨 论 PCR技 术 的 应 用 PCR仪 以 “ DNA复 制 ” 为 背 景 材 料 ， 设 计 问 题 ， 导 入 新 课 ， 首先 回 顾 DNA的 结 构 和 复 制 的 有 关 知 识 ， 然 后 了 解 PCR技 术 的原 理 和 应 用 ， 接 着 讲 解 PCR技 术 的 反 应 过 程 及 具 体 实 验 操 作步 骤 ， 后 以 视 频 观 看 来 再 次 学 习 实 验 的 知 识 点 。 最 后 通 过 课堂 检 测 完 善 所 学 内 容 。 通 过 对 PCR反 应 过 程 的 教 学 ， 应 以 读 图 识 图 为 主 。 教 材中 反 应 过 程 图 解 详 细 的 描 绘 了 参 与 PCR的 各 种 组 成 成 分 ； 每一 轮 反 应 的 三 个 基 本 步 骤 变 性 、 复 性 、 延 伸 ； 每 一 步 骤 的作 用 。 在 教 学 中 分 析 图 形 的 同 时 ， 结 合 教 科 书 中 的 文 字 说 明来 加 深 理 解 。 参 与 的 组 分 在 DNA复 制 中 的 作 用解 旋 酶DNA母 链4种 脱 氧 核 苷 酸DNA聚 合 酶引 物1.胞 内 DNA复 制 的 基 本 体 系一 、 基 础 知 识 打 开 DNA双 链提 供 DNA复 制 的 模 板合 成 子 链 的 原 料催 化 合 成 DNA子 链使 DNA聚 合 酶 能 够 从 引 物 的 3端 开 始 连 接 脱 氧 核 苷 酸(一 ） PCR原 理 2.DNA双 链 方 向 与 复 制 关 系 （ 2） DNA聚 合 酶 只 能 从 3 端 延 伸 DNA链 ， 故 DNA复 制 需 要 引 物 。（ 1） DNA的 羟 基 “ OH” 末 端 称 为 3 端 ， 而 磷 酸 基 团 的 末 端 称 为 5 端 。DNA合 成 总 是 从 子 链 的5 端 向 3 端 伸3 端5 端 3.PCR原 理（ 1） DNA的 热 变 性 原 理 通 过 控 制 温 度 来 控 制 双 链 的 解 聚 与 结 合 变 性 ： 80 100 C的 温 度 范 围 内 ， DNA双 螺 旋 结 构 解 体 ， 双 链 分 开加 热 变 性 复 性 ： 温 度 缓 慢 降 低 后 ， 两 条 彼 此 分 离 的 DNA链 重 新 结 合 成 双 链缓 慢 冷 却 复 性（ 2） 耐 高 温 的 Taq DNA聚 合 酶 （ 3） 缓 冲 液 为 PCR反 应 提 供 的 物 质 DNA模 板 ， 分 别 与 两 条 模 板 链 相 结 合 的 两 种 引 物 ， 四 种 脱 氧 核 苷 酸 ，耐 热 的 DNA聚 合 酶 ， 同 时 通 过 控 制 温 度 使 DNA复 制 在 体 外 反 复 进 行【 方 法 点 拨 】 细 胞 内 复 制 和 PCR不 同 点 PCR过 程 需 要 的 引 物 不 是 RNA， 而 是 人 工 合 成 的 DNA单 链 ， 其 长 度 通常 为 20 30个 脱 氧 核 苷 酸 PCR过 程 中 DNA的 解 旋 不 依 靠 解 旋 酶 ， 而 是 通 过 对 反 应 温 度 的 控 制来 实 现 的 （ 二 ） PCR的 反 应 过 程PCR一 般 要 经 历 三 十 多 次 循 环 ， 每 次 循 环 分 为 变 性 、 复 性 和 延 伸 三 步(1)变 性温 度 上 升 到 90 以 上 时 ， 双 链 DNA解 旋 为 单 链 。(2)复 性温 度 下 降 到 50 左 右 ， 两 种 引 物 通 过 碱 基 互 补 配 对 与 两 条 单链 DNA结 合 。 温 度 上 升 到 72 左 右 ， 溶 液 中 的 四 种 脱 氧 核 苷 酸 (A、 T、 C、 G)在DNA聚 合 酶 的 作 用 下 ， 根 据 碱 基 互 补 配 对 原 则 合 成 新 的 DNA链 。(3)延 伸【 方 法 点 拨 】(1)72 左 右 时 ， TaqDNA聚 合 酶 有 最 大 活 性 ， 可 使 DNA新 链 由 5 端向 3 端 延 伸 。(2)DNA聚 合 酶 只 能 特 异 性 地 复 制 处 于 两 个 引 物 之 间 的 DNA序 列 ， 使该 段 固 定 长 度 的 序 列 呈 “ 指 数 式 ” 扩 增 。 标 准 的 PCR过 程 一 般 分 为 变 性 、 复 性 、 延 伸 三 大 步 ， 这 三 大 步 需 要的 温 度 依 次 是 ( )A 92 、 50 、 72 B 72 、 50 、 92 C 50 、 92 、 72 D 80 、 50 、 72 栏目链接【 典 型 例 题 】A【 方 法 点 拨 】1.变 性 ： 温 度 上 升 到 90 (90 96 )以 上 时 ， 双 链 DNA解 旋 为 单 链2.复 性 ： 温 度 下 降 到 50 (40 60 )左 右 时 ， 两 种 引 物 通 过 碱 基互 补 配 对 与 两 条 单 链 DNA结 合3.延 伸 ： 溶 液 中 的 四 种 脱 氧 核 苷 酸 (A、 T、 C、 G)在 Taq DNA聚 合 酶的 作 用 下 ， 根 据 碱 基 互 补 配 对 原 则 合 成 新 的 DNA链 二 、 实 验 操 作1.PCR仪（ 一 ） 设 备 及 用 具一 台 能 够 自 动 调 控 温 度 的 仪 器2.微 量 离 心 管一 种 薄 壁 塑 料 管 ， 总 容积 为 0.5ml3.微 量 移 液 器用 于 定 量 转 移 PCR配 方 中 的 液体 ， 其 上 的 一 次 性 吸 液 枪 头 用一 次 更 换 一 次 1.准 备2.移 液（ 二 ） 实 验 操 作 步 骤按 照 PCR反 应 体 系 的 配 方 将 所 需 用 的 试 剂 摆 放 在 实 验 桌 上 。用 微 量 移 液 器 按 照 PCR反 应 体 系 配 方 往 微 量 离 心 管 里 面 加入 各 种 试 剂 。3.混 合 过 程 ： 盖 严 微 量 离 心 管 口 的 盖 子 ， 用 手 指 轻 轻 弹 击 管 壁 。 注 意 :A.离 心 管 口 的 盖 子 一 定 盖 严 ， 防 止 实 验 中 脱 落 或 液 体 外 溢 。B.手 指 轻 轻 弹 击 微 量 离 心 管 的 管 壁 ， 目 的 是 使 反 应 液 混 合 均 匀 。4.离 心 过 程 ： 将 微 量 离 心 管 放 在 离 心 机 上 ,离 心 约 10s。 目 的 ： 使 反 应 液 体 集 中 在 离 心 管 底 部 ， 提 高 反 应 效 果 。 循 环 数 变 性 复 性 延 伸第 一 次 94 C， 10min 30次 4 ， 30s 55 ， 30s 72 ， 1min最 后 一 次 4 ， 1min 55 ， 30s 72 ， 1min5.反 应将 离 心 管 放 入 PCR仪 上 ， 设 置 好 PCR仪 的 循 环 程 序 。【 注 意 事 项 】 避 免 外 源 DNA等 因 素 的 污 染 隔 离 操 作 区 ， 所 用 微 量 离 心 管 、 枪 头 、 缓 冲 液 以 及 蒸 馏 水 等 在 使用 必 须 进 行 高 压 灭 菌 ； 分 装 试 剂 ， 简 化 操 作 程 序 ， 使 用 一 次 性 枪 头 。 在 PCR实 验 操 作 中 ， 下 列 说 法 不 正 确 的 是 ( )A 在 微 量 离 心 管 中 添 加 各 种 试 剂 时 ， 只 需 一 个 枪 头B 离 心 管 的 盖 子 一 定 要 盖 严 ， 防 止 液 体 外 溢C 用 手 轻 弹 离 心 管 壁 的 目 的 是 使 反 应 液 充 分 混 合D 离 心 的 目 的 是 使 反 应 液 集 中 在 离 心 管 部 ， 提 高 反 应 效 果变 式训 练 栏目链接【 典 型 例 题 】 A3.离 心 10s的 目 的 是 使 反 应 液 集 中 在 离 心 管 部 ， 提 高 反 应 效 果 。【 方 法 点 拨 】1.在 微 量 离 心 管 中 添 加 各 种 试 剂 时 ， 每 吸 取 一 种 试 剂 后 ， 移液 器 上 的 枪 头 必 须 更 换 ， 以 确 保 实 验 的 准 确 性 ；2.离 心 管 的 盖 子 一 定 要 盖 严 ， 防 止 实 验 中 脱 落 或 液 体 外 溢 ； （ 一 ） 理 论 上 DNA扩 增 数 目 的 计 算1.一 条 DNA， 复 制 n次 ， DNA为 2n 2.a条 DNA， 复 制 n次 ， DNA为 a 2n（ 二 ） 实 验 中 DNA含 量 的 测 定1.原 理可 以 通 过 计 算 DNA含 量 来 评 价 扩 增 的 效 果 ， DNA在 260nm的 紫 外 线 波段 有 一 强 烈 的 吸 收 峰 ， 峰 值 的 大 小 与 DNA的 含 量 有 关三 、 课 题 成 果 评 价2.过 程 稀 释 2uLPCR反 应 液 ， 加 入 98uL蒸 馏 水 ， 即 将 样 品 进 行 50倍 稀 释 对 照 调 零 以 蒸 馏 水 作 为 空 白 对 照 ， 在 波 长 260nm处 ， 将 紫 外 分 光 光 度计 的 读 数 调 节 至 零 计 算 取 DNA稀 释 液 100uL至 比 色 杯 中 ， 测 定 260nm处 的 光 吸 收 值 计 算 DNA含 量 （ g） 50 x(260nm的 读 数 ） x 稀 释 倍 数50： 1 g /mL的 DNA在 厚 度 为 1cm比 色 杯 中 的 吸 光 值 为 0.02紫 外 分 光 度 计 比 色 杯四 、 课 题 延 伸PCR技 术 是 80年 代 中 期 发 展 起 来 的 体 外 核 酸 扩 增 技 术 。 它 具 有 特 异 、敏 感 、 产 率 高 、 快 速 、 简 便 、 重 复 性 好 、 易 自 动 化 等 突 出 特 点 例 如 ： PCR产 物 每 轮 循 环 增 加 一 倍 ， 30轮 循 环 扩 增 量 达 2 30个 拷贝 （ 109拷 贝 ） 【 课 堂 小 结 】一 、 PCR原 理1.变 性 ： 温 度 上 升 到 90 (90 96 )以 上 时 ， 双 链 DNA解 旋 为 单 链2.复 性 ： 温 度 下 降 到 50 (40 60 )左 右 时 ， 两 种 引 物 通 过 碱 基互 补 配 对 与 两 条 单 链 DNA结 合3.延 伸 ： 溶 液 中 的 四 种 脱 氧 核 苷 酸 (A、 T、 C、 G)在 Taq DNA聚 合 酶的 作 用 下 ， 根 据 碱 基 互 补 配 对 原 则 合 成 新 的 DNA链二 、 PCR操 作1.准 备 2.移 液 3.混 合 4.离 心 5.反 应 PCR过 程 与 细 胞 内 的 DNA复 制 过 程 相 比 ， 主 要 有 两 点 不 同 ， 它 们 是 （ ） PCR过 程 需 要 的 引 物 是 人 工 合 成 的 单 链 DNA或 RNA PCR过 程 不 需 要 DNA聚 合 酶 PCR过 程 中 DNA的 解 旋 不 依 靠 解 旋 酶 ， 而 是 通 过 对 反 应 温 度 的 控 制 来 实现 的 PCR过 程 中 ， DNA不 需 要 解 旋 ， 直 接 以 双 链 DNA为 模 板 进 行 复 制A B C D 【 课 堂 练 习 】 C【 方 法 点 拨 】1.PCR过 程 需 要 耐 高 温 的 DNA聚 合 酶2.PCR过 程 中 ， DNA不 依 靠 解 旋 酶 解 旋 ， 而 是 利 用 高 温 解 旋 ， 然 后 以 单链 DNA为 模 板 进 行 复 制