显微镜的直接计数和细菌大小测定

实 验 微 生 物 大 小 的 测 定 和 显 微 直 接 计 数 一 、 实 验 目 的1、 学 会 测 微 尺 和 血 球 计 数 板 的 使 用 方 法 。2、 建 立 对 微 生 物 大 小 的 概 念 。二 、 实 验 材 料1、 显 微 镜 、 物 镜 测 微 尺 、 目 镜 测 微 尺 、 血 球 计数 板 、 载 玻 片 等 。2、 麦 芽 汁 培 养 基 、 酵 母 菌 。3、 吸 管 、 吸 水 纸 等 。 三 、 实 验 原 理(一 )微 生 物 大 小 的 测 定 原 理 所 有 微 生 物 的 大 小 需 要 用 刻 有 一 定 刻 度的 测 微 尺 来 测 量 ， 先 用 绝 对 长 度 的 物 镜 测 微尺 来 校 正 不 表 示 绝 对 长 度 的 目 镜 测 微 尺 ， 计算 后 者 每 格 所 代 表 的 实 际 长 度 ， 然 后 放 上 待测 的 标 本 ， 用 目 镜 测 微 尺 测 定 标 本 上 微 生 物细 胞 占 目 镜 测 微 尺 的 格 数 ， 就 可 计 算 该 微 生物 的 大 小 。 (二 )显 微 镜 直 接 计 数 原 理 微 生 物 常 用 的 计 数 方 法 有 两 种 ， 即 直 接 计数 法 和 间 接 计 数 法 。 前 者 利 用 血 球 计 数 板 在 显微 镜 下 直 接 计 数 ， 能 立 即 得 到 数 值 ， 但 死 活 细胞 都 计 数 在 内 。 后 者 是 在 平 板 上 长 成 菌 落 后 再计 数 ， 反 应 较 真 实 ， 但 费 时 太 长 。 本 实 验 是 利用 血 球 计 数 板 进 行 直 接 计 数 。 计 数 前 需 对 样 品做 适 当 稀 释 ， 按 照 规 定 方 法 及 计 算 公 式 运 算 后 ，即 可 得 出 实 际 数 值 。 四 、 操 作 方 法(一 )酵 母 菌 大 小 测 定 的 操 作 方 法1.测 微 尺 的 构 造 和 使 用 方 法(1)目 镜 测 微 尺 的 构 造 目 镜 测 微 尺 是 一 块 圆 形 玻 片 ，其 中 央 刻 有 精 确 的 刻 度 ， 通 常 是 将 5mm划 分 为 50格 ， 实 际 每 格 等 于 100 m。 刻 度 的 大 小 是 随 使 用的 接 目 镜 和 接 物 镜 的 放 大 倍 数 而 改 变 ， 用 前 必 须 用物 镜 测 微 尺 来 标 定 ， 如 图 。(2)物 镜 测 微 尺 的 构 造 物 镜 测 微 尺 为 一 块 特 制 的载 玻 片 ， 其 中 央 有 一 小 圆 圈 。 圆 圈 内 刻 有 分 度 ， 将长 1mm的 直 线 等 分 为 100小 格 ， 每 小 格 等 于 10 m，如 图 。 2.目 镜 测 微 尺 的 标 定(1)取 下 接 目 镜 ， 旋 下 目 镜 上 的 目 透 镜 ， 将 目 镜 测 微尺 放 人 接 目 镜 的 中 隔 板 上 ， 使 有 刻 度 的 一 面 朝 下 ，再 旋 上 目 透 镜 ， 并 装 入 镜 筒 内 。(2)将 物 镜 测 微 尺 置 于 显 微 镜 的 载 物 台 上 ， 使 有 刻 度的 一 面 朝 上 ， 同 观 察 标 本 一 样 ， 使 具 有 刻 度 的 小 圆圈 位 于 视 野 中 央 。(3)先 用 低 倍 镜 观 察 ， 对 准 焦 距 ， 待 看 清 物 镜 测 微 尺的 刻 度 后 ， 转 动 目 镜 ， 使 目 镜 测 微 尺 的 刻 度 与 物 镜测 微 尺 的 刻 度 相 平 行 ， 并 使 两 尺 的 左 边 第 一 条 线 相重 合 ， 再 向 右 寻 找 两 尺 的 另 外 一 条 重 合 线 。 如 图 (4)记 录 二 条 重 合 线 间 的 目 镜 测 微 尺 的 格 数 和 物 镜 测微 尺 的 格 数 。 3.计 算 方 式(1)目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 =两 个 重 叠 刻 度 间 物 镜测 微 尺 格 数 10 两 个 重 叠 刻 度 间 目 镜 测 微 尺格 数(2)以 同 样 方 法 ， 分 别 在 不 同 倍 率 的 物 镜 下 测 定测 微 尺 上 每 格 的 实 际 长 度 。目 镜 测 微 尺 ( )格 =物 镜 测 微 尺 ( )格目 镜 测 微 尺 每 格 =( )(3)如 此 测 定 后 的 目 镜 测 微 尺 的 尺 度 ， 仅 适 用 于测 定 时 所 用 的 显 微 镜 的 目 镜 和 物 镜 的 放 大 倍 数 。若 更 换 物 镜 、 目 镜 的 放 大 倍 数 时 ， 必 须 再 进 行校 正 标 定 。 4.酵 母 菌 大 小 的 测 定(1)取 下 镜 台 测 微 尺 ， 换 上 酵 母 菌 水 浸 制 片 。(2)测 量 菌 体 的 长 度 和 宽 度 各 占 目 镜 测 微 尺几 格 ， 然 后 换 算 出 菌 体 的 实 际 长 度 。(3)在 同 一 标 本 上 测 定 5-10个 菌 体 ， 求 其 平均 值 。 (二 )显 微 镜 直 接 测 定 酵 母 细 胞 数 的 操 作 方 法1.血 球 计 数 板 的 构 造 血 球 计 数 板 是 由 一 块 比 普 通 载 玻 片 厚 的 特 制玻 片 制 成 的 。 玻 片 中 有 四 条 下 凹 的 槽 ， 构 成 三 个平 台 。 中 间 的 平 台 较 宽 ， 其 中 间 又 被 一 短 横 槽 隔为 两 半 ， 每 半 边 上 面 个 刻 有 一 个 方 格 网 。 方 格 网上 刻 有 9个 大 方 格 ， 其 中 只 有 中 间 的 一 个 大 方 格 为计 数 室 ， 供 微 生 物 计 数 用 。 这 一 大 方 格 为 边 长 为1mm正 方 形 ， 深 度 为 0.1mm， 其 体 积 为 0.1mm3。 计 数 室 通 常 有 两 种 规 格 。 一 种 是 大 方 格 内 分 为 16中 格 ， 每 一 中 格 又 分 为 25小 格 ； 另 一 种 是 大 方 格内 分 为 25中 格 ， 每 一 中 格 又 分 为 16小 格 。 但 是 不管 计 数 室 是 哪 一 种 构 造 ； 它 们 都 有 一 个 共 同 的 特点 ， 即 每 一 大 方 格 都 是 由 16 25=25 16=400个小 方 格 组 成 。 如 图2.血 球 计 数 板 的 使 用(1)用 血 球 计 数 板 计 数 酵 母 菌 悬 液 的 酵 母 菌 个 数 。(2)样 品 稀 释 的 目 的 是 便 于 酵 母 菌 悬 液 的 计 数 ， 以每 小 方 格 内 含 有 4-5个 酵 母 细 胞 为 宜 ， 一 般 稀 释10倍 即 可 。 (3) 将 血 球 计 数 板 用 擦 镜 纸 擦 净 ， 在 中 央 的 计 数 室上 加 盖 专 用 的 厚 玻 片 。(4) 将 稀 释 后 的 酵 母 菌 悬 液 ， 用 吸 管 吸 取 一 滴 置 于盖 玻 片 的 边 缘 ， 使 菌 液 缓 缓 渗 入 ， 多 余 的 菌 液 用 吸水 纸 吸 取 ， 捎 待 片 刻 ， 使 酵 母 菌 全 部 沉 降 到 血 球 计数 室 内 。(5) 计 数 时 ， 如 果 使 用 16格 25格 规 格 的 计 数 室 ，要 按 对 角 线 位 ， 取 左 上 、 右 上 、 左 下 、 右 下 4个 中格 （ 即 100个 小 格 ） 的 酵 母 菌 数 。 如 果 规 格 为 25格 16格 的 计 数 板 ， 除 了 取 其 4个 对 角 方 位 外 ， 还 需再 数 中 央 的 一 个 中 格 (即 80个 小 方 格 )的 酵 母 菌 数 。 (6) 当 遇 到 位 于 大 格 线 上 的 酵 母 菌 ， 一 般 只 计数 大 方 格 的 上 方 和 右 方 线 上 的 酵 母 细 胞 (或 只计 数 下 方 和 左 方 线 上 的 酵 母 细 胞 )。(7) 对 每 个 样 品 计 数 三 次 ， 取 其 平 均 值 ， 按 下列 公 式 计 算 每 1ml菌 液 中 所 含 的 酵 母 菌 个 数 。 3.计 算 公 式(1)16格 25格 的 血 球 计 数 板 计 算 公 式 ： 酵 母 细 胞 数 ml=100小 格 内 酵 母 细 胞 个 数 100 400 104 稀 释 倍 数(2)25格 16格 的 血 球 计 数 板 计 算 公 式 ： 酵 母 细 胞 数 ml=80小 格 内 酵 母 细 胞 个 数 80 400 104 稀 释 倍 数 4.血 球 计 数 板 的 清 洁 血 球 汁 数 板 使 用 后 ， 用 自 来 水 冲 洗 ，切 勿 用 硬 物 洗 刷 ， 洗 后 自 行 晾 干 或 用 吹 风机 吹 干 ， 或 用 95 的 乙 醇 、 无 水 乙 醇 、 丙酮 等 有 机 溶 剂 脱 水 使 其 干 燥 。 通 过 镜 检 观察 每 小 格 内 是 否 残 留 菌 体 或 其 他 沉 淀 物 。若 不 干 净 ， 则 必 须 重 复 清 洗 直 到 干 净 为 止 。 五 、 实 验 报 告 及 思 考 题1、 微 生 物 大 小 测 定 实 验 结 果（ 1） 将 目 镜 测 微 尺 校 正 结 果 填 入 下 表 ：接 目 镜 的 放 大 倍 数 _（ 2） 酵 母 细 胞 大 小 的 测 量 结 果 ： 微 生 物名 称 目 镜 测 微 尺 每格 代 表 的 长 度/m 宽 长 菌 体 大 小范 围 /m目 镜 测 微尺 格 数 宽 度/m 目 镜 测 微尺 格 数 长 度 /m酵 母 菌 2、 显 微 镜 直 接 计 数 结 果 将 结 果 记 录 于 下 表 中 ， A表 示 五 个 中 方 格 中 的 总菌 数 ； B表 示 菌 液 稀 释 倍 数 。 各 中 格 中 菌 数 A B 二 室 平均 值 菌 数 /ml1 2 3 4 5第 一 室第 二 室 16小 格 25大 格 计 数 室 25小 格 16大 格 计 数 室 计数室的两种刻度形式