分解纤维素的微生物的分离[精制资料]

纤维素：棉花棉花是自然是自然界中纤维素界中纤维素含量最高的含量最高的天然产物；天然产物；纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中；1 1、在、在草食性动物等的消化道内草食性动物等的消化道内，也，也共生有分解纤维素共生有分解纤维素的微生物的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。而人没有分解纤维素的能力。2 2、农作物秸秆农作物秸秆：米秸、麦秸、稻草、草、木屑米秸、麦秸、稻草、草、木屑米秸、麦秸、稻草、草、木屑米秸、麦秸、稻草、草、木屑 等富等富含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源 科学家正致力于研究，怎样将科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物、木材及生长更为迅农业废弃物、木材及生长更为迅速的草本植物，速的草本植物，转化为种类繁多转化为种类繁多的生物燃料的生物燃料（甚至是航空燃油）。（甚至是航空燃油）。课题课题3分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离（一一）纤维素与纤维素酶纤维素与纤维素酶纤维素纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。纤维素酶纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括由微生物分泌的一种复合酶，包括C C1 1酶酶、C Cx x酶和葡萄糖苷酶，由于它们的酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用协同作用，最终将纤维素分，最终将纤维素分解成葡萄糖。解成葡萄糖。纤维素纤维素C C C C1 1 1 1酶酶C C C Cx x x x酶酶纤维二糖纤维二糖葡萄糖葡萄糖苷苷 酶酶葡萄糖葡萄糖取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：实验：纤维素酶分解纤维素的实验纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入10mL0.1mol/L10mL0.1mol/L的醋酸的醋酸 醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液甲甲 乙乙在甲试管中加入在甲试管中加入1mL1mL蒸馏水，蒸馏水，乙试管加入乙试管加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶将试管放在将试管放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？刚果红染色法刚果红染色法 刚果红能刚果红能与像纤维素的多糖形成红色复合物与像纤维素的多糖形成红色复合物，而而不与不与水解后的水解后的纤维二糖和葡萄糖纤维二糖和葡萄糖发生该反应。发生该反应。（二二）纤维素分解菌的筛选纤维素分解菌的筛选 用用加入刚果红的纤维素培养基加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物去培养微生物时，如果培养基中出现时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时以菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落可说明该菌落是纤维素分解菌是纤维素分解菌，因为它已将被刚，因为它已将被刚 果红果红 染成红色的纤维素分解了。染成红色的纤维素分解了。一、实一、实 验验 设设 计计 请你根据实验流程图和提供的三个资料以及请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提示操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。个详细的实验方案。土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品将样品涂布在鉴别涂布在鉴别纤纤 维素分解菌的维素分解菌的培养基培养基上上 筛选产生筛选产生透透 明圈的明圈的菌落菌落*取样环境取样环境1 1、土壤取样：、土壤取样：富含纤维素富含纤维素的环境（树林中多年落叶形成的环境（树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等）的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等）操作步骤操作步骤讨论讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于般应将滤纸埋于深约深约10cm10cm左右的土壤中。左右的土壤中。2 2、选择培养、选择培养 增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。样品中分离所需要的微生物。目的：目的：制备选择培养基制备选择培养基操作：操作：P29 培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水提示：提示：自变量为培养基的种类，即自变量为培养基的种类，即完全培养基和选择培养基。完全培养基和选择培养基。可用可用完全培养基做对照完全培养基做对照,或将纤维素改为葡萄糖。或将纤维素改为葡萄糖。A A A A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？是是是是液体液体液体液体培养基，原因是配方中培养基，原因是配方中培养基，原因是配方中培养基，原因是配方中无凝固剂无凝固剂无凝固剂无凝固剂（琼脂）（琼脂）（琼脂）（琼脂）B B B B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？是如何进行选择的？是如何进行选择的？是如何进行选择的？有有选择作用，本配方中选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源纤维素作为主要碳源，只有能，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。分解纤维素的微生物可以大量繁殖。C C C C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 说明：说明：分析分析“纤维素分解菌的选择纤维素分解菌的选择培养基配方培养基配方”可知，该配方中的可知，该配方中的酵母膏也酵母膏也能够提供少量的碳源能够提供少量的碳源，因此其他微生物也，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。但因酵母膏的能在该培养基中生长繁殖。但因酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。微生物才能大量繁殖。在选择培养的条件下，可以使那些在选择培养的条件下，可以使那些能够能够适应适应该营养条件该营养条件的微生物的微生物得到得到迅速迅速繁殖繁殖，而那些，而那些不适应不适应这种营养条件的微这种营养条件的微生物的繁殖被生物的繁殖被抑制抑制，因此可以起到，因此可以起到“浓浓缩缩”的作用。的作用。为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需微生物？所需微生物？按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培养后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。3.3.梯度稀释梯度稀释1011021031041051064.4.将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养基上的培养基上（1 1）制备）制备鉴别培养基鉴别培养基P29P29（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂布到平板培养基上，涂布到平板培养基上，3030倒置培养倒置培养。培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基水溶性羧甲基纤维素钠纤维素钠)方法一：先方法一：先 ，再加入刚果红进，再加入刚果红进行颜色反应。行颜色反应。方法二：在方法二：在 时就加入刚果红。时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板5.刚果红染色法刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落即为分解纤维素的菌落。即为分解纤维素的菌落。这两种方法各有哪些优点与不足？这两种方法各有哪些优点与不足？染色法染色法染色法染色法优优优优点点点点缺点缺点缺点缺点方法一方法一方法一方法一方法二方法二方法二方法二有透明圈的有透明圈的基基本本是能分解纤是能分解纤维素的微生物维素的微生物操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发生刚果红会使菌落之间发生混杂混杂操作简便不操作简便不存在菌落混存在菌落混杂问题杂问题1.1.产生淀粉酶的微生物产生淀粉酶的微生物也也产生产生模糊透明圈模糊透明圈2.2.有些微生物能降解色素有些微生物能降解色素，形成形成明显的透明圈明显的透明圈。方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能力就强！当然分解纤维素的能力就强！土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到布到鉴别鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么什么样的样的环境环境取样取样?培养的培养的目的目的?选择培养基的选择培养基的特点特点?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落?鉴别培养基鉴别培养基特点特点?如何鉴别如何鉴别?根据根据：微生物：微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相应要求，到相应环境中去找；环境中去找；增加纤维素分解菌增加纤维素分解菌浓度，浓度，确保能够从确保能够从样品中分离到纤维样品中分离到纤维素分解菌；素分解菌；液体培养基液体培养基是固体是固体培养基培养基刚果红刚果红染色法染色法实验回顾实验回顾挑选挑选有有透明圈透明圈的的菌落菌落 在在产生明显的透明圈产生明显的透明圈的菌落，挑的菌落，挑取并取并接种接种到纤维素分解菌的到纤维素分解菌的选择培选择培养基养基上，在上，在30300 0C C 37370 0C C培养，可获培养，可获得得纯化培养纯化培养。纯化培养纯化培养四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。同的分离结果。为了确定分离得到的是纤维素分解菌，为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行还需要进行_实验，纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖 五、课题延伸思考：本实验课题思考：本实验课题2 2中的实验流程有哪些异同？中的实验流程有哪些异同？课题课题2 2将土样梯度将土样梯度稀释液直接涂布稀释液直接涂布在以尿素为在以尿素为唯一氮源的唯一氮源的选择培养基选择培养基上，上，分离并统计分离并统计菌落。菌落。本课题本课题先选择培养先选择培养，使使纤维素分解菌得到纤维素分解菌得到增殖增殖后，再后，再稀释涂布在鉴别培养基稀释涂布在鉴别培养基上，上，挑选挑选菌落。菌落。土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到布到鉴别鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么什么样的样的环境环境取样取样?培养的目的培养的目的?选择培养基的选择培养基的特点特点?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落?鉴别培养基鉴别培养基的特点的特点?如何鉴别如何鉴别?根据根据：微生物：微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相应要求，到相应环境中去找；环境中去找；目的：目的：增加纤维素增加纤维素分解菌的浓度，分解菌的浓度，以以确保能够从样品中确保能够从样品中分离到所需要的微分离到所需要的微生物；生物；刚果红染色法刚果红染色法分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结DNA重组技术重组技术下列不属于微生物的是下列不属于微生物的是 ()A蓝藻和蘑菇蓝藻和蘑菇 B葫芦藓和铁线蕨葫芦藓和铁线蕨 C噬菌体和黄曲霉噬菌体和黄曲霉 D放线菌和变形虫放线菌和变形虫【解析解析】病毒、原核生物病毒、原核生物(例如细菌、放线菌、例如细菌、放线菌、支原体、蓝藻支原体、蓝藻)、真核类的藻类和真菌及原生、真核类的藻类和真菌及原生动物都是微生物。而一般多细胞的植物与动物动物都是微生物。而一般多细胞的植物与动物不属于微生物，如葫芦藓是苔藓植物，铁线蕨不属于微生物，如葫芦藓是苔藓植物，铁线蕨是蕨类植物，都属于多细胞高等植物。是蕨类植物，都属于多细胞高等植物。【答案答案】B微生物营养物质微生物营养物质有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量C除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量【解析解析】不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况具体分析。对于生物的具体情况具体分析。对于A、B选项，它的表述是不完选项，它的表述是不完整的。有的碳源只能是碳源，如整的。有的碳源只能是碳源，如CO2；有的碳源可同时是氮源，；有的碳源可同时是氮源，如如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，还是能源，如蛋白胨。对于时是氮源，还是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如机物种类繁多，功能也多样。如CO2可作自养型微生物的碳源；可作自养型微生物的碳源；NaHCO3可作自养型微生物的碳源和无机盐；而可作自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提则只能提供无机盐。对于供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。可为硝化细菌提供能量和氮源。【答案答案】D微生物与病毒的关系微生物与病毒的关系关于病毒增殖的叙述中，正确的是（关于病毒增殖的叙述中，正确的是（）A病毒侵入宿主细胞后，合成一种蛋白质病毒侵入宿主细胞后，合成一种蛋白质 B病毒的繁殖只在宿主的活细胞中进行病毒的繁殖只在宿主的活细胞中进行C病毒的繁殖以核衣壳为单位病毒的繁殖以核衣壳为单位 D在普通的培养基上能培养病毒在普通的培养基上能培养病毒【解析解析】解答此题需从以下几方面入手分析：首先，病毒是解答此题需从以下几方面入手分析：首先，病毒是营寄生方式生活，必须生活在活的细胞内，不能独立生活，营寄生方式生活，必须生活在活的细胞内，不能独立生活，所以在普通的培养基上不能生活。第二，繁殖时，病毒的核所以在普通的培养基上不能生活。第二，繁殖时，病毒的核酸进入宿主细胞，利用宿主的成分合成子代个体，除了核衣酸进入宿主细胞，利用宿主的成分合成子代个体，除了核衣壳，还应包括该病毒的其他结构。合成的蛋白质不只是一种，壳，还应包括该病毒的其他结构。合成的蛋白质不只是一种，应该是多种，包括多种结构蛋白质及物质合成时所需的多种应该是多种，包括多种结构蛋白质及物质合成时所需的多种酶。酶。【答案答案】B培养基的种类培养基的种类要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（）A加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基 B加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基 C固体培养基固体培养基 D液体培养基液体培养基【解析解析】微生物的分离需使用固体培养基，由于某微生物的分离需使用固体培养基，由于某种细菌的种类不明，所以难以使用选择培养基，如种细菌的种类不明，所以难以使用选择培养基，如加入青霉素的培养基可以分离到酵母菌和霉菌，加加入青霉素的培养基可以分离到酵母菌和霉菌，加入高浓度食盐的培养基可以分离到金黄色葡萄球菌。入高浓度食盐的培养基可以分离到金黄色葡萄球菌。【答案答案】C微生物的计数微生物的计数产生标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（产生标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（）A一个细菌，液体培养基一个细菌，液体培养基 B许多细菌，液体培养基许多细菌，液体培养基C一个细菌，固体培养基一个细菌，固体培养基 D许多细菌，固体培养基许多细菌，固体培养基【解析解析】菌落是一个或几个细菌的子细胞群体，在菌落是一个或几个细菌的子细胞群体，在固体培养基上，有一定的形态结构，肉眼可见，菌固体培养基上，有一定的形态结构，肉眼可见，菌落可作为菌种鉴别的重要依据，而多种细菌形成的落可作为菌种鉴别的重要依据，而多种细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态。菌落，就不可能有比较标准的形态。【答案答案】C