《凝胶层析原理》PPT课件.ppt

小 结 名 称 原 理 电 极 缓冲 液 支 持 介质 电 泳 形式 加 样 方式 染 色 液 分 辨 率醋 酸 纤 维素 电 泳琼 脂 糖 凝胶 电 泳PAGEIEFSDS- PAGE 层 析CHROMATOGRAPHY 一 、 概 述 1、 定 义 层 析 (又 名 色 谱 ) 一 种 利 用 混 合 物 中各 组 分 的 物 理 化 学 性 质间 的 差 异 ， 使 各 组 分 在层 析 两 相 中 以 不 同 程 度分 配 ， 借 此 将 各 组 分 分离 。 分 子 极 性分 子 大 小分 子 形 状离 子 亲 和 力分 子 亲 和 力吸 附 能 力 凝 胶 层 析离 子 交 换 层 析亲 和 层 析2、 物 理 化 学 性 质 间 的 差 异吸 附 层 析 LL 层 析 分 析 法 的 基 本 原 理 ：流动相Mobilephase固定相Stationaryphase样本分子依其分子极性选择亲和两相之一吸附层析分配层析Liquid - Solid Liquid - Liquid两相系统A B C每次分离样本都要做一次选择One Plate ofSeparation(理论板数) S极性L非极性极性非极性样本样本 1903年 俄 国 植 物 学 家 茨 维 特 发 表 了 有 关 填 充 以 菊 根 粉 的 玻 璃 柱 分 离 植物 色 素 ， 以 石 油 醚 冲 洗 ， 得 到 黄 色 、 绿 色 区带 ; 1931年 ， Kuhn采 用 柱 色 谱 分 离 了 类 胡 萝 卜 素1941年 ， Martin和 Synge提 出 分 配 色 谱 法 1944年 ， Martin等 又 提 出 纸 色 谱 法 1952年 ， Martin和 James发 明 了 气 液 色 谱 法1955年 ， 第 一 台 商 品 气 相 色 谱 问 世 ， 标 志 着 现 代 色 谱 分 析 的 建 立1956年 ， Stahl系 统 研 究 了 薄 层 色 谱 法 (TLC) 1958年 ， Stein和 Moore研 制 出 氨 基 酸 分 析 仪 ， 确 定 了 核 糖 核酸 的 分 子 结 构1967年 ， Horvvath和 Huber等 研 制 了 高 效 液 相 色 谱 (high-performance liquid chromatography,HPLC)仪1975年 ， Small等 提 出 离 子 色 谱 20世 纪 80年 代 ， 超 临 界 色 谱20世 纪 90年 代 ， 毛 细 管 电 泳 （ 1809年 Ress第 一 次 电 泳 实 验 ）21世 纪 ， 联 用 技 术 、 大 分 子 色 谱 分 离 、 制 备 色 谱 可 望 取 得 更大 的 发 展 层 析 法 进 行 时 有 两 个 相 ， 一 个 相称 为 固 定 相 ， 另 一 相 称 为 流 动 相 。支 持 物 含 待 分 离 物 质 气相层析液相层析 气 -固 气 -液 液 -固 液 -液二 .层 析 技 术 的 分 类1. 按 两 相 所 处 的 状 态 分 类以 气 体 作 为 流 动 相以 液 体 作 为 流 动 相 2.按 层 析 的 机 制 可 分 为adsorption chromatography partition chromatography gel chromatographyaffinity chromatography ion-exchange chromatography n 定 义 指 混 合 物 随 流 动 相 通 过 吸附 剂 时 ， 由 于 吸 附 剂 对不 同 物 质 的 吸 附 力 而 使混 合 物 分 离 的 方 法（ 1） 吸 附 层 析 在 单 位 时 间 内 被 吸 附 于 吸 附 剂 的 某 一 表 面 积 上 的 分 子 和同 一 单 位 时 间 内 离 开 此 表 面 的 分 子 之 间 可 以 建 立 动 态 平 衡 ，吸 附 层 析 就 是 不 断 地 产 生 平 衡 与 不 平 衡 ， 吸 附 与 解 吸 n 常 用 的 吸 附 剂 硅 胶 聚 酰 胺 氧 化 铝 活 性 炭磷 酸 钙 , （ 2） 分 配 层 析 利 用 不 同 组 分 在 流 动 相 和 固 定 相 中 的 分配 系 数 不 同 而 进 行 分 离 的 方 法 。 n 柱 层 析 colum chromatography 进 样 量 大 且 容 易 回 收n 薄 层 层 析 thin layper chromatography 小 量 样 品 ， 快 速 ， 操 作 简 便3.按 制 备 量 分 类 ：圆 形 滤 纸长 条 滤 纸 薄 层 层 析(TLC) 柱 层 析 容 量 变 大 容 量 更 大加 展 开 液 薄 层 层 析 三 .层 析 的 一 般 原 理 1.分 配 系 数 Partition coefficient 表 示 一 种 物 质 在 两 种 特 定 相 （ 流 动 相 和 固 定相 ） 中 分 配 程 度 溶 质 在 固 定 相 中 的 浓 度 CsK= = 溶 质 在 流 动 相 中 的 浓 度 Cm特 定 的 温 度 ： 常 数K大 ： 被 固 定 相 吸 附 的 牢 固 ， 随 流 动 相 的 移 动 速 度 较 慢 。 纯 化 生 物 物 质 的 纯 度 取 决 于 混 合 物 中 各 组 分 K 值 的 差 异 程 度 混 合 物 中 各 组 分 若 K值 相 差 较 大 , 则 能较 易 地 把 混 合 物 中 的 生 物 物 质 分 离 。 反之 ,K值 相 差 较 小 ,不 易 把 混 合 物 中 的 生 物 物质 分 离 1 2 3 4 5 K=1K=0.1 凝 胶 层 析Gel Chromatography凝 胶 过 滤 （ gel filtration） (Porath, Flodin, 1959)分 子 筛 层 析 （ molecular sieve chromatography） (Hjertn, Mosbach, 1962)排 阻 层 析 （ exclusion chromatography） (Pedersen, 1962) 指 混 合 物 随 流 动 相 经 固 定 相 的 层 析 柱 时 ，混 合 物 中 各 组 份 按 其 分 子 大 小 不 同 而 被 分 离的 技 术 。 一 、 基 本 原 理 固 定 相 （ 凝 胶 ）n 三 维 空 间 网 状 结 构 A good gel for gel filtration contains about95% water 固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出 分 子 筛 效 应 ： 分 子 大 小 不 同 ,在 凝 胶 受 到 的阻 滞 作 用 有 差异 ,从 而 造 成 各组 分 在 凝 胶 柱中 的 迁 移 速 度不 同 得 到 分 离 。 凝 胶 层 析 过 程 的 数 理 关 系 1、 柱 床 体 积 (VT) VT = 1/4 D2h 2、 洗 脱 体 积 （ Ve）n 即 欲 分 离 物 质 通 过 层 析 柱 洗 脱 下 来 所 需 洗 脱 液 的总 体 积 。3、 外 水 体 积 （ V0） 即 存 在 于 柱 床 内 凝 胶 外 面 空 隙之 间 的 水 相 体 积 ， 相 应 于 一 般 层 析 法 中 流 动 相 的体 积 。 4、 内 水 体 积 （ Vi） 即 凝 胶 颗 粒 内 部 所 含 水 相 的 体积 ， 它 可 从 干 凝 胶 颗 粒 重 量 和 吸 水 重 量 求 得 。5、 凝 胶 干 体 积 （ Vg） 柱 床 体 积 VT凝 胶 干 体 积 Vg内 水 体 积 Vi存 在 于 柱 床 内 凝 胶外 面 空 隙 之 间 的 水相 体 积 ， 相 应 于 一般 层 析 法 中 流 动 相的 体 积 。 颗 粒 内 部 所 含 水 相的 体 积 它 可 从 干 凝胶 颗 粒 重 量 和 吸 水重 量 相 减 求 得 。 凝 胶 体 积 以 及 颗 粒 内外 间 隙 体 积 的 总 和 。 VT = 1/4 D2h 外 水 体 积 V0 VT = Vg + V0 + Vi数 理 关 系 Ve Vo Kd = Vi6、 分 配 系 数 （ Kd ） ：特 点 ：（ 1） 与 被 分 离 物 质 分 子 的大 小 和 凝 胶 颗 粒 孔 隙 的 大小 有 关 （ 2） 与 柱 的 长 短 粗 细 无 关 (2)Ve = Vo + Vi Kd = 1n分 子 完 全 不 被 排 阻n完 全 向 凝 胶 颗 粒 内部 扩 散n在 两 相 分 配 的 比 值为 1,最 后 流 出 .(1)Ve = Vo Kd = 0n分 子 完 全 被 排 阻于 凝 胶 颗 粒 之 外n全 部 分 布 于 流 动相 里 ,n最 先 流 出 。 (3) 0 Kd 1 Ve = Vo +ViKd为 溶 质 以 某 种 程 度向 凝 胶 颗 粒 内 扩 散 三 .凝 胶 层 析 的 优 点 1.凝 胶 是 一 种 不 带 电荷 的 惰 性 载 体 ， 结构 稳 定 2.操 作 条 件 较 温 和 。 3.样 品 得 率 高 ,重 复性 好 ,可 进 行 大 量 样品 的 分 离 纯 化 四 、 凝 胶 层 析 的 缺 点1.要 求 样 品 和 洗 脱 液 的粘 度 很 低 2.凝 胶 颗 粒 网 络 孔 径 大小 非 常 有 限 ,所 以 可被 纯 化 的 物 质 的 分 子量 范 围 受 到 限 制 3.凝 胶 结 构 对 某 些 溶 质分 子 具 有 吸 附 作 用 五 、 凝 胶 的 结 构 与 性 能 1.葡 聚 糖 凝 胶1959年 Porath和 Flodin合 成（ 商 品 名 为 Sephadex） （ 1） 结 构 ：基 本 骨 架 ： 葡 聚 糖 （ dextran）交 联 剂 ： 3-氯 代 -1 ,2-环 氧 氯丙 烷 使 葡 聚 糖 之 间 通 过 醚 键交 联 聚 合 而 成 的 三 维 空 间 网状 结 构 （ 2） 特 点 ：交 联 度 ：n 交 联 剂 越 多 交 联 度 越 大 网 孔 结 构 越 紧 密n 交 联 剂 越 少 交 联 度 越 小 网 孔 结 构 越 疏 松 化 学 性 质 ： 稳 定 ,不 溶 于水 、 盐 、 弱 酸 、碱 和 一 般 有 机 溶剂 , 耐 热 耐 碱 不耐 强 酸 （ 2） 特 点 ：Sephadex的 分 级 范 围 G10 700G15 1,500G25 1,000-5,000G-50 1,500-30,000G-75 3,000-70,000G100 4,000-150,000G150 5,000-400,000G200 5,000-800,000 n G类 的 型 号表 示 每 克 干 凝 胶 吸水 量 （ ml） x10如 G-50 每 克 干 凝 胶吸 水 量 为 5ml n 大 孔 凝 胶n 工 作 范 围 的 下 限 几 乎 是 Sephadex的 上 限n 可 分 离 MW40万 以 上 的 物 质n 可 用 来 分 离 核 酸 及 病 毒 。2.琼 脂 糖 凝 胶 （ 商 品 名 为 Sepharose)3.聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 各种层析胶体： PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacel glucoseagaroseglucose + acrylamidecelluloseBio-RadBioGel PBioGel A acrylamideagarose 六 .其 它 条 件 选 择 七 、 应 用 Elution volume (ml) Albumin NaCln Desalting in a simple column Ve log Mr 实 验 ： 凝 胶 层 析 法 分 离 蛋 白 质 血 红 蛋 白 64,480二 硝 基 苯 -鱼 精 蛋 白 2,000-12,000Sephadex G-50 孔 径 1,500-30,000一 、 原 理 ： 1、 装 柱 先 用 蒸 馏 水 赶 走 层 析 柱 中 的 死 体 积 凝 胶 不 能 有 气 泡 和 分 层 现 象 装 柱 结 束 后 要 保 持 凝 胶 表 面 平 整 二 、 操 作 注 意 点 ： 凝 胶 柱 的 装 填 方 法 ：装填胶体 暂停流洗X继续流洗已堆积沉淀中上清紧密堆积检查好管柱是否畅通12 GelGel继续流洗 2、 加 样 使 液 面 和 凝 胶 表 面 相 切 ， 关 闭 出 口 加 样 时 尽 量 不 要 破 坏 凝 胶 面 让 样 品 进 入 凝 胶 以 后 在 加 蒸 馏 水 开 始 洗 脱 血 红 蛋 白 和 二 硝 基 苯 -鱼 精 蛋 白 的洗 脱 体 积 ？三 、 结 果 要 求 ：