染色质免疫共沉淀实验具体方法及步骤

染色质免疫共沉淀（Chip）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物 抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特 异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有 抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目 的。一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10顷平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓 度为1% （培养基共有9 ml）。2. 37C 孵育 10 min。3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿 中。混匀后，在室温下放置5 min即可。4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每 200ul含2x106个细胞。这样每100 ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制 剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为 4x106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共 800 ul。7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4C离心10 min。去除不溶物质。2. 留取300ul做实验，其余保存于-80C。3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组； 100皿加入4 ul 5 M NaCl （NaCl终浓度为0.2 M），65C处理3 h解交联， 跑电泳，检测超声破碎的效果。4. 在100 ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul 的 50xPIC。再各加入 60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4C颠转混匀 1 h。5. 1 h后，在4C静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min。6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体，另一管中则 不加抗体4C颠转过夜。三、检验超声破碎的效果(第一天)1. 取100 ul超声破碎后产物，加入4 ul 5M NaCl，65C处理2 h解交联。2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。四、免疫复合物的沉淀及清洗(第二天)1. 孵育过夜后，每管中加入 60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4C颠转 2 h。2. 4C静置10 min后，700 rpm离心1 min。除去上清。3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4C颠转10 min，4C静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min，除去上清。洗涤溶液：(1) low salt wash buffer-one wash(2) highsalt wash buffer-one wash(3) LiCl wash buffer-one wash(4) TE buffer-two wash4. 清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3，800 ul ddH2O，共 1 ml。每管加入250 ul洗脱buffer，室温下颠转15 min，静置离心后，收集上清。 重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。5. 解交联：每管中加入20 ul 5M NaCl (NaCl终浓度为0.2 M)。6. 混匀，65C解交联过夜。五、DNA样品的回收(第三天)1. 解交联结束后，每管加入1 ul RNaseA (MBI), 37C孵育1 h。2. 每管加入 10 ul 0.5 M EDTA, 20 ul1M Tris.HCl (PH6.5), 2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45C处理2 h。3. DNA片段的回收omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ulddHO。2六、PCR分析(第三天)汪意1. 注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在 IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。2. 注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨 架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲 液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶 解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗 体共沉的悲惨结果。3. 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温 下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检 出抗原，过多则就不能沉降在beads 上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解 抗原，过多则抗原被稀释。一、染色质免疫共沉淀简介真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色 质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉 淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内 DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质一 DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免 疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的 片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检 测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与 基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与 基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高 通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点； RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进 一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。二、ChIP的一般流程甲醛处理细胞-收集细胞，超声破碎-加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合-加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀- 对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合-洗脱，得到富集的靶 蛋白-DNA复合物-解交联，纯化富集的DNA-片断-PCR分析。三、PCR分析ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎 干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人 员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。目前ChIP-chip技术研究主要集中 于两个领域：及转录因子的结合和条件特异性；组蛋白的修饰，组蛋白修饰蛋 白和染色体重建。ChIP-chip在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在 组蛋白的修饰、组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是，可以在体内进行反应；在给定的检验细胞环境的模式下得到 DNA相互关系的简单影像；使用特异性修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转 录修正的蛋白质的相关位点；直接或者间接（通过蛋白质与蛋白质的相互作 用）的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是：需要一个特异性蛋白质抗 体，有时难于获得；为了获得高丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶 标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。总之，ChIP-chip技术的发展为析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提 供了一个极为有力的工具。在未来的研究中，将对芯片的构建进行改进，提高 其实用性。使用易于获得抗体，增加这种方法的可用性。在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量 PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR 了。此外还有一些由ChIP衍生出来的 方法。例如RIP （其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合， 具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候 需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip （其实就是ChIP富集得到的 DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不 同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。