医学生物化学课件

生物化学 BIOCHEMISTRY 王泽平 生物化学与分子生物学教研室 蛋白质的结构与功能 第 1章 Structure and Function of Protein 什么是蛋白质 ? 蛋白质 (protein)是由许多氨基酸 (amino acids)通过肽键 (peptide bond)相 连形成的高分子含氮化合物 。 蛋白质研究的历史 1833年 ， 从麦芽中分离淀粉酶；随后从胃液中 分离到类似胃蛋白酶的物质 。 1864年 ， 血红蛋白被分离并结晶 。 19世纪末 ， 证明蛋白质由氨基酸组成 ， 并合成 了多种短肽 。 20世纪初 ， 发现蛋白质的二级结构；完成胰岛 素一级结构测定 。 20世纪中叶 ， 各种蛋白质分析技术相继建立 ， 促进了蛋白质研究迅速发展； 1962年 ， 确定了血红蛋白的四级结构 。 20世纪 90年代 ， 功能基因组与蛋白质组研究地 展开 。 蛋白质的生物学重要性 分布广： 所有器官 、 组织都含有蛋白质；细胞 的各个部分都含有蛋白质 。 含量高： 蛋白质是细胞内最丰富的有机分子 ， 占人体干重的 45 ， 某些组织含量更高 ， 例如 脾 、 肺及横纹肌等高达 80 。 1. 蛋白质是生物体重要组成成分 作为生物催化剂 （ 酶 ） 代谢调节作用 免疫保护作用 物质的转运和存储 运动与支持作用 参与细胞间信息传递 2. 蛋白质具有重要的生物学功能 3. 氧化供能 蛋白质的分子组成 The Molecular Component of Protein 第一节 组成蛋白质的元素 主要有 C、 H、 O、 N和 S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、 铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有 碘 。 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为 16 。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主 ， 因此 ， 只要测定生物样品中的含氮量 ， 就 可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含 量： 100克样品中蛋白质的含量 (g %) = 每克样品含氮克数 6.25 100 1/16% 蛋白质元素组成的特点 一、组成人体蛋白质的 20种氨基酸 均属于 L-氨基酸 存在自然界中的氨基酸有 300余种 ， 但组成人体蛋白质的氨基酸仅有 20种 ， 且均属 L-氨基酸 （ 甘氨酸除外 ） 。 H 甘氨酸 CH3 丙氨酸 L-氨基酸的通式 R C + N H 3 C O O - H 非极性脂肪族氨基酸 极性中性氨基酸 芳香族氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸 二、氨基酸 可根据侧链结构和理化性质 进行分类 (一 )侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族 氨基酸 (二 )侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性 中性氨基酸 (三 )侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸 (四 )侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸 (五 )侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性 氨基酸 几种特殊氨基酸 脯氨酸 （亚氨基酸） CH 2 CHCOO - NH 2 + CH 2 CH 2 半胱氨酸 + 胱氨酸 二硫键 -HH - OOC - CH - CH 2 - S + NH 3 S - CH 2 - CH - COO - + NH 3 - OOC - CH - CH 2 - SH + NH 3 HS - CH 2 - CH - COO - + NH 3 三、 20种氨基酸具有共同或特异的理化性质 两性解离及等电点 氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所 处溶液的酸碱度。 等电点 (isoelectric point, pI) 在某一 pH的溶液中 ， 氨基酸解离成阳离子和 阴离子的趋势及程度相等 ， 成为兼性离子 ， 呈电 中性 。 此时溶液的 pH值 称为该氨基酸的 等电点 。 （一）氨基酸具有两性解离的性质 pH=pI +OH- pHpI +H+ +OH- +H+ pHpI 氨基酸的兼性离子 阳离子 阴离子 CH NH 2 C O O HR CH NH 3 + C O O -R CH NH 2 C O O -RCH C O O HR NH 3 （二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质 色氨酸、酪氨酸的 最大吸收峰在 280 nm 附近。 大多数蛋白质含有 这两种氨基酸残基 ， 所 以测定蛋白质溶液 280nm的光吸收值是分 析溶液中蛋白质含量的 快速简便的方法 。 芳香族氨基酸的紫外吸收 （三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物 氨基酸与茚三酮水合物共热 ， 可生成 蓝 紫色 化合物 ， 其最大吸收峰在 570nm处 。 由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正 比关系 ， 因此可作为氨基酸定量分析方法 。 四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成 的多肽链 肽键 (peptide bond)是由一个氨基酸的 - 羧基与另一个氨基酸的 -氨基脱水缩合而形成 的化学键 。 （一） 氨基酸通过肽键连接而形成肽 (peptide) NH 2 - CH - C H O OH 甘 氨 酸甘 氨 酸 NH - CH - C H OH O H 甘 氨 酸 + -HOH 甘氨酰甘氨酸 肽键 NH 2 - CH - C - N - CH - C O OHHHH O 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化 合物 。 两分子氨基酸缩合形成二肽 ， 三分子氨基 酸缩合则形成三肽 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团 不全 ， 被称为氨基酸残基 (residue)。 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽 (oligopeptide)， 由更多的氨基酸相连形成的肽 称多肽 (polypeptide)。 N 末端：多肽链中有 游离 -氨基 的一端 C 末端：多肽链中有 游离 -羧基 的一端 多肽链有两端： 多肽链 (polypeptide chain)是指许多氨 基酸之间以肽键连接而成的一种结构 。 N末端 C末端 牛核糖核酸酶 （二） 体内存在多种重要的生物活性肽 1. 谷胱甘肽 (glutathione, GSH) GSH过氧 化物酶 H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶 NADPH+H+ NADP+ GSH与 GSSG间的转换 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽 (neuropeptide) 2.多肽类激素及神经肽 蛋白质的分子结构 The Molecular Structure of Protein 第二节 蛋白质的分子结构包括 : 高级 结构 一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure) 定义 : 蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从 N-端至 C-端的 氨基酸排列顺序 。 一、 氨基酸的排列顺序决定蛋白质 的一级结构 主要的化学键 : 肽键 ，有些蛋白质还包括二硫键。 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学 功能 的基础 ， 但不是决定蛋白质空间构象的 唯一因素 。 二、 多肽链的局部主链构象为蛋白质 二级结构 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间 结构 ， 即该段肽链主链骨架原子的相对空 间位臵 ， 并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。 定义 : 主要的化学键 ： 氢键 （一）参与肽键形成的 6个原子在同一平面上 参与肽键的 6个原子 C1、 C、 O、 N、 H、 C2位于同一平 面 ， C1和 C2在平面上所处的位臵为反式 (trans)构型 ， 此同 一平面上的 6个原子构成了所谓的 肽单元 (peptide unit) 。 （一）参与肽键形成的 6个原子在同一平面上 参与肽键的 6个原子 C1、 C、 O、 N、 H、 C2位于同一平 面 ， C1和 C2在平面上所处的位臵为反式 (trans)构型 ， 此同 一平面上的 6个原子构成了所谓的 肽单元 (peptide unit) 。 -螺旋 ( -helix) -折叠 (-pleated sheet) -转角 (-turn) 无规卷曲 (random coil) （二） -螺旋结构是常见的蛋白质二级结构 蛋白质二级结构 -螺旋 （三） -折叠使多肽链形成片层结构 （四） -转角和无规卷曲在蛋白质分子中 普遍存在 -转角 无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部 分肽链结构。 （五）模体 是具有特殊功能的超二级结构 在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具 有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一 个 有规则的二级结构组合，被称为 超二级结构 。 二级结构组合形式有 3种： ， ， 。 二个或三个具有二级结构的肽段，在空间 上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为 模体 (motif) 。 模体是具有特殊功能的超二级结构。 钙结合蛋白中结合 钙离子的模体 锌指结构 -螺旋 -转角（或 环） -螺旋模体 链 -转角 -链模体 链 -转角 -螺旋 - 转角 -链模体 模体常见的形式 （六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响 蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。 一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成 -螺旋 或 -折叠，它就会出现相应的二级结构。 三、 在二级结构基础上多肽链进一步折叠 形成蛋白质三级结构 疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。 主要的化学键 : 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位臵。 即肽链中所有原子在三维空间的排布位臵。 定义 : （一）三级结构是指整条肽链中全部氨基酸 残基的相对空间位置 肌红蛋白 (Mb) N 端 C 端 纤连蛋白分子的结构域 （二）结构域 是三级结构层次上的局部折叠区 分子量较大的蛋白质常可折叠成多个结构较为紧 密的区域，并各行其功能，称为结构域 (domain) 。 （三）分子伴侣 参与蛋白质折叠 分子伴侣 (chaperon)通过提供一个保护环境从而 加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随 后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生， 使肽链正确折叠。 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚 后，再诱导其正确折叠。 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确 形成起了重要的作用。 伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用 亚基之间的结合主要是氢键和离子键。 四、 含有二条以上多肽链的蛋白质 具有四级结构 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接 触部位的布局和相互作用，称为 蛋白质的四级 结构 。 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链， 每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白 质的 亚基 (subunit)。 由 2个亚基组成的蛋白质四级结构中 ， 若亚基分子 结构相同 ， 称之为 同二聚体 (homodimer)， 若亚基分子 结构不同 ， 则称之为 异二聚体 (heterodimer)。 血红蛋白的 四级结构 五、蛋白质的分类 根据蛋白质组成成分 : 单纯蛋白质 结合蛋白质 = 蛋白质部分 + 非蛋白质部分 根据蛋白质形状 : 纤维状蛋白质 球状蛋白质 六、蛋白质组学 （一）蛋白质组学基本概念 蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表 达的全部蛋白质，即“一种基因组所表达的 全套蛋白质”。 （二）蛋白质组学研究技术平台 蛋白质组学是高通量，高效率的研究 : 双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析 （三）蛋白质组学研究的科学意义 蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein 第三节 （一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构 是高级结构 与功能的基础 牛核糖核酸酶的 一级结构 二 硫 键 天然状态， 有催化活性 尿素、 -巯基乙醇 去除尿素、 -巯基乙醇 非折叠状态，无活性 （二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级 结构与功能 胰岛素 氨基酸残基序号 A5 A6 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 猪 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val Ala 羊 Ala Ser Val Ala 马 Thr Ser Ile Ala （三） 氨基酸序列提供重要的生物化学信息 一些广泛存在于生 物界的蛋白质如细胞色 素 (cytochrome C)，比 较它们的一级结构，可 以帮助了解物种进化间 的关系。 （四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病 例：镰刀形红细胞贫血 N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbS 肽链 HbA 肽 链 N-val his leu thr pro val glu C(146) 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病， 称为“分子病”。 肌红蛋白 /血红蛋白 含有血红素辅基 血红素结构 二、 蛋白质的功能依赖特定空间结构 （一） 血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似 肌红蛋白 (myoglobin， Mb) 肌红蛋白是一个只有三级 结构的单链蛋白质 ， 有 8段 -螺 旋结构 。 血红素分子中的两个丙酸 侧链以离子键形式与肽链中的 两个碱性氨基酸侧链上的正电 荷相连 ， 加之肽链中的 F8组氨 酸残基还与 Fe2+形成配位结合 ， 所以血红素辅基与蛋白质部分 稳定结合 。 血红蛋白 (hemoglobin， Hb) 血红蛋白具有 4个亚 基组成的四级结构 ， 每 个亚基可结合 1个血红素 并携带 1分子氧 。 Hb亚基之间通过 8 对盐键 ， 使 4个亚基紧密 结合而形成亲水的球状 蛋白 。 Hb与 Mb一样能可逆地与 O2结合 ， Hb 与 O2结合后称为 氧合 Hb。 氧合 Hb占总 Hb 的百分数 （ 称 百分饱和度 ） 随 O2浓度变化 而改变 。 （二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基 与氧结合 肌红蛋白 (Mb)和血红蛋白 (Hb)的氧解离曲线 协同效应 (cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配 体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基 与配体结合能力的现象，称为 协同效应 。 如果是促进作用则称为 正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为 负协同效应 (negative cooperativity) O2 血红素与氧结 合后 ， 铁原子半径 变小 ， 就能进入卟 啉环的小孔中 ， 继 而引起肽链位臵的 变动 。 变构效应 (allosteric effect) 蛋白质空间结构的改变伴随其功能 的变化 ， 称为 变构效应 。 （三）蛋白质构象改变 可引起疾病 蛋白质构象疾病 ：若蛋白质的折叠发生 错误 ， 尽管其一级结构不变 ， 但蛋白质的构 象发生改变 ， 仍可影响其功能 ， 严重时可导 致疾病发生 。 蛋白质构象改变导致疾病的机理 ：有些蛋 白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解 酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现 为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。 这类疾病包括 ：人纹状体脊髓变性病、老 年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。 疯牛病是由朊病毒蛋白 (prion protein, PrP) 引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的 PrP富含 -螺旋，称为 PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全 为 -折叠的 PrPsc，从而致病。 PrPc -螺旋 PrPsc -折叠 正常 疯牛病 疯牛病中的蛋白质构象改变 第四节 蛋白质的理化性质 The Physical and Chemical Characters of Protein 一、 蛋白质具有两性电离的性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外 ， 氨基酸残基侧链中某些基团 ， 在一定的溶液 pH条 件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团 。 当蛋白质溶液处于某一 pH时 ， 蛋白质解离成 正 、 负离子的趋势相等 ， 即成为兼性离子 ， 净电 荷为零 ， 此时溶液的 pH称为 蛋白质的等电点 。 蛋白质的等电点 ( isoelectric point, pI) 二、蛋白质具有胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一 ， 分子量可自 1 万至 100万之巨 ， 其分子的直径可达 1 100nm， 为胶粒范围之内 。 颗粒表面电荷 水化膜 蛋白质胶体稳定的因素 : + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 水化膜 + + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒 酸 碱 酸 碱 酸 碱 脱水作用 脱水作用 脱水作用 溶液中蛋白质的聚沉 三、蛋白质空间结构破坏而引起变性 在某些物理和化学因素作用下 ， 其特定的 空间构象被破坏 ， 也即有序的空间结构变成无 序的空间结构 ， 从而导致其理化性质改变和生 物活性的丧失 。 蛋白质的变性 (denaturation) 造成变性的因素 : 如 加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、 重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质 : 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白 质的一级结构。 应用举例 : 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及 灭菌。 此外 , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质 制剂（如疫苗等）的必要条件。 若蛋白质变性程度较轻 ， 去除变性因素 后 ， 蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构 象和功能 ， 称为 复性 (renaturation) 。 天然状态， 有催化活性 尿素、 -巯基乙醇 去除尿素、 -巯基乙醇 非折叠状态，无活性 在一定条件下 ， 蛋白疏水侧链暴露在外 ， 肽 链融会相互缠绕继而聚集 ， 因而从溶液中析出 。 变性的蛋白质易于沉淀 ， 有时蛋白质发生沉 淀 ， 但并不变性 。 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固 的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 蛋白质沉淀 蛋白质的凝固作用 (protein coagulation) 四、蛋白质 在紫外光谱区有特征性吸收峰 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸 和色氨酸，因此在 280nm波长处有特征性吸收 峰。蛋白质的 OD280与其浓度呈正比关系，因 此可作蛋白质定量测定。 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚 三酮反应。 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与 硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双 缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解 程度。 五、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质 溶液含量 1. 茚三酮反应 (ninhydrin reaction) 2. 双缩脲反应 (biuret reaction) 第五节 蛋白质的分离纯化与结构分析 The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein 一、 透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的 小分子化合物 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一 定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液 的目的。 透析 (dialysis) 超滤法 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合 物分开的方法 。 二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用 的蛋白质沉淀方法 使用 丙酮沉淀 时，必须在 0 4 低温下进行， 丙酮用量一般 10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外， 也可用乙醇沉淀。 盐析 (salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或 氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷 被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 免疫沉淀法： 将某一纯化蛋白质免疫动物可获得 抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的 抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从 蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 三、利用荷电性质可用电泳法将 蛋白质分离 蛋白质在高于或低于其 pI的溶液中为带电的 颗粒 ， 在电场中能向正极或负极移动 。 这种通过 蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技 术 , 称为 电泳 (elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同 ， 可分为薄膜电泳 、 凝胶 电泳等 。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ，常用于蛋白质分子 量的测定。 等电聚焦电泳 ，通过蛋白质等电点的差异而分 离蛋白质的电泳方法。 双向凝胶电泳 是蛋白质组学研究的重要技术。 几种重要的蛋白质电泳 : 四、 应用相分配或亲和原理可将蛋白质 进行层析分离 待分离蛋白质溶液 （ 流动相 ） 经过一个固 态物质 （ 固定相 ） 时 ， 根据溶液中待分离的蛋 白质颗粒大小 、 电荷多少及亲和力等 ， 使待分 离的蛋白质组分在两相中反复分配 ， 并以不同 速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 层析 (chromatography)分离蛋白质的原理 离子交换层析： 利用各蛋白质的电荷量及性 质不同进行分离。 凝胶过滤 (gel filtration)又称分子筛层析 ，利 用各蛋白质分子大小不同分离。 蛋白质分离常用的层析方法 五、 利用蛋白质颗粒沉降行为不同 可进行超速离心分离 超速离心法 (ultracentrifugation)既可以 用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋 白质的分子量。 蛋白质在离心场中的行为用 沉降系数 (sedimentation coefficient, S)表示，沉 降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 因为沉降系数 S大体上和分子量成正比 关系 ， 故可应用超速离心法测定蛋白质分子 量 ， 但对分子形状的高度不对称的大多数纤 维状蛋白质不适用 。 六、应用化学或反向遗传学方法可分析 多肽链的氨基酸序列 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用 Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸 顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨 基酸顺序的结果。 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定 DNA序列 排列出 mRNA序列 七、应用物理学、生物信息学原理 可进行蛋白质空间结构测定 二级结构测定 通常采用 圆二色光谱 (circular dichroism， CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量 。 -螺旋的 CD峰有 222nm处的负峰 、 208nm处的 负峰和 198 nm处的正峰三个成分；而 -折叠的 CD谱不很固定 。 三级结构测定 X射线衍射法 (X-ray diffraction)和核磁共 振技术 (nuclear magnetic resonance, NMR)是 研究蛋白质三维空间结构最准确的方法 。 同源模建 ：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白 质序列对齐 补偿氨基酸替补、插入和缺失 通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构 。序列相似性越高，预测的模型也越准确。 折叠识别 ：通过预测二级结构、预测折叠方式和参 考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维 结构。 从无到有 ：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向， 加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维 结构。 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构：