β-半乳糖苷酶活性测定方法

。半乳糖昔酶活性测定方法8-半乳糖苷酶活性测定邛-galactosidase assays ）1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待 OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌 的酶活性）2、取50-1005菌液至1.5 ml的离心管中，加370-420 Z buffer;3、加20 pl氯仿和10 pl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置 于冰上30分钟；4、向离心管中加入100 pl浓度4 mg/ml的ONPG，混匀后立即 置于30C反应30-60分钟；5、待颜色变黄后，加入250 pl 1 M Na2CO3中止反应，准确记 录变色反应的时间；6、取200pl上清，测定420 nm和550 nm处的吸光度；7、计算8-半乳糖苷酶酶活力：Miller Units =1,000x（OD420 - 1.75xOD550） /（txVxOD600）,其中，OD420和OD550-显色后的反应液读数；OD600-用于显色分析的培养液的细菌密度；t显色反应时间（单位min）；V -用于显色分析的培养液体积（单位ml）。Z buffer （总体积 100 ml）:Na2HPO412H2O 100mM 3.5814 gNaH2PO4H2O 40mM 0.624gKCl 10mM 0.07455gMgSO47H2O1mM 0.0246g8-mercaptoethanol 5.4pl / ml 540pl加水到总体积90 ml ,待试剂溶解后调pH至7.0，最后定容到 100 ml,4C 储存。Substrate solution（总体积10ml）现用现配Na2HPO412H2O 60mM 0.215 g NaH2PO4H2O 40mM 0.0624g ONPG 4mg/ml 0.04g终止液（100ml）: Na2CO3 1M 10.6g