肿瘤模型专题

肿瘤模型专项1. 最新的药效学指引原则规定化药临床迈进行至少5种人源肿瘤的体内抗癌活性评价,以拟定药效及抗瘤谱。2. 瘤株对药物的敏感性通过体外筛选可以阐明,而体内评价更大限度上是考虑药物经体内吸取、分布、代谢之后的活性，由于目前的肿瘤模型多采用皮下接种，并不能完全反映药物的组织分布对其影响，因此感觉这种规定就显得不是很必要。注解:体内的敏感性不是仅考虑吸取分布代谢的影响，某些样品,体外活性都是不错的,体内甚至是瘤内直接注射给到很高剂量都没有效果,肿瘤细胞在体内和体外的生存环境差别很大,体外模拟的生存环境完全不能体现出体内的状态。3. 皮下接种是一种目前能找到的最佳的权宜之计了,事实上，DA明确表达,鼓励原位肿瘤模型,但是由于技术的因素，诸多瘤株都无法实现。而皮下模型有它的一系列长处:稳定，便于观测,易于构建，易于控制等等，可以在一定限度上反映药物通过体内过程的疗效,因此目前只能用它来进行评价。4. 事实上原位肿瘤模型仍然不能较好的反映临床肿瘤的特点，目前可以预见得到最佳的模型应当是通过基因修饰(转基因等)的可以集中比较均匀的自发模型，这才是和临床最接近的肿瘤模型。但是目前的通过基因修饰的自发肿瘤模型种类很少,并且可控制性差，周期长,因此还要通过很长时间的改善才干大规模的应用。5. 常规的肿瘤细胞株接种后如果不能成瘤,细胞悬液就会被动物吸取6. 瘤体积可用游标卡尺量最长径（a）和最短径（b),体积计算公式：Vb2/,每-3天测一次。体积=宽*长/的公式计算肿瘤体积；抑瘤率=(对照组-治疗组)/对照组*100;； tumorsize=wth2 length 0.52); ab2/6；有关肿瘤体积的计算：1926./6约等于/。如果想做得讲究一点,应当用RTV计算肿瘤体积: V(某日某老鼠的相对肿瘤体积)=TV(测量当天该老鼠的肿瘤体积）/TV（分组当天该老鼠的肿瘤体积)*10，在此基本上进行平均值SD等数据的计算7. 与否必须称重小鼠的胸腺和脾脏8. 超过7天的腹水再传代就很容易浮现血性；动物的周龄也不要太大，6周左右。传代次数太多也很容易浮现血性腹水。血性腹水可以离心后加0.17 N的NH4CL溶液破红细胞，然后精确某些的控制条件（接种量,传代时间，动物周龄等）传几代,诸多状况下再传一两代后会有不血性的种鼠浮现，然后用这只种鼠的腹水继续传代9. 皮下接种与剥瘤子:小鼠肿瘤剥瘤子是一种艰难的过程，但是可以一定限度上的改善一下:接种的时候要精确控制接种在皮下，靠皮内会与皮肤强烈粘连，靠肌肉会与肌肉强烈粘连，并且不要太靠腋窝里面，可以往尾部靠某些,也可以稍微的往背部靠一点,不要往腹部靠，容易使肿瘤被垫料磨烂。10. LD50是毒理中的半数致死量，E50是体外实验中的半数有效量,一般体内实验没有类似的指标，如果想比较几种类似物的药效还是做量效曲线比较好。11. 剂量设立应当按照LD10(10%致死剂量，也叫最大耐受剂量)来分组，一般分别采用 1LD, 1/ LD10, 1/7LD或 /1L,但最大剂量不得超过LD1。这里面还得考虑ED 50，LD10与D的剂量相差越大越好。 用LD50作为原则设立剂量是不现实的,由于动物实验是不也许容许10%以上动物死亡的。12. 说到疗效的比较,如只是发文章，比较不同基团之间也许对母体抑瘤率的影响,一般做做体外实验,比一比人们的IC50就好了,不太做体内。如是真正的筛药,我个人有些观点:这个不是孤立起来看某个或者某几种剂量下谁比谁的抑瘤率高。重要要看谁更具有可开发性。一方面,要考虑它的毒性以及治疗窗口的大小，通俗的说,就是这个要在发挥疗效的剂量下，毒性与否大?例如A药，10mg抑瘤率有50%，但是体重下降了20%；而B药，0m的时候主线无效,3mg的时候有0的抑瘤率,6mg的时候抑瘤率高达8%，并且体重几乎没有下降，这个时候A药与药如何比较？特别如果是公司筛选新药,还要考虑成本，病人可接受度（动物上的有效剂量换算到人一天要吃斤，这种药也是不现实的)，制剂,工艺等等方面。如果单纯从药理的角度给出答案,至少要考虑毒性和剂量限制的问题。13. 有关剂量选择,LD50的几分之一是一种比较通用的措施,目前相对更合理某些的剂量选择是做一种简朴的多次给药的毒理实验来拟定剂量，我们一般会持续给药一周，然后再观测一周,这样摸出来的最大剂量可以直接用于药效实验,然后其她的剂量都在此剂量的基本上往下减。14. 说到给药疗程，一般初筛的药物都是持续每天给药，q。 但是给药途径,特别是i.与ip的选择，我们都是先做一种简朴的K实验考察一下,再拟定，特别是如果PK实验的成果显示,血药浓度甚至达不到体外C5的浓度,那么与否进行体内实验,就有待商榷了。持续i.p,小鼠的皮肤有时候会变厚,你可以换一边给药。15. 动物选择:M小鼠,裸鼠，C5等均可作为，但是个人觉得K能做出来最佳，毕竟比较有普遍性,还是正常生理状态的健康动物，比较有说服力,还便宜,裸鼠或者其她特定品种，比较适合特定的瘤株16. 有关肿瘤细胞活力的问题: 一般培养的肿瘤细胞活力往往是不够的,很难在短时间内长到规定重量,因此建议至少在动物体内传2代,让肿瘤细胞活力充足体现后来再开始用于实验 传代多次的因素在于让肿瘤细胞充足活化，要不活化也行,多接种点吧17. 有关接种部位的问题:以小鼠为例一般可以选择腋下或者后肢,背部血管不发达,营养不够,一般不建议采用.接种一般采用皮下注射,针头沿皮肤水平进入,然后挑起表皮,注射18. 有关肿瘤重量的问题: 模型组肿瘤重量应当不低于0.19. 肺内原位注射制作肿瘤模型效果颇好,流程如下:麻醉-固定皮肤消毒-剪开左侧胸部皮肤,大概第2-3肋间的位置-用镊子轻轻拨开皮下筋膜,可以看到呼吸运动的肺叶将准备好的肿瘤细胞注射入肺,30微升-分层缝合OK20. 胸膜活检穿刺针 规格:#20 #25(14G 2） L 65 mm；用途:供人体胸腔穿刺,钩取胸膜活体组织用21. 开始做肿瘤药效评价，应当采用18这些小鼠肿瘤模型。一种方面这些肿瘤对于药物很敏感,并且周期短，耗费也少。但如果要成药,裸鼠模型是必需的。22. 一般瘤重的在平均值的780%如下就还凑活,美丽一点的是在0如下，实在不行，100也勉强,就是特别难看，但是S越大，记录上就越不利23. 皮下肿瘤模型中，腋下最适合肿瘤生长。接种时由裸鼠体侧腰部稍靠上的部位进针,要保证与接种点的距离不不小于针头的长度，向头部方穿行，绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层，当针头达到接种位点时注射,退出针头，这样操作的目的并不完全是避免漏液,其实纯熟后,不需要皮下穿行也不会漏液,重要是避免污染,进针点尚有少量污染的也许性的，针头在皮下穿行一段后,接种点离进针点较远,最大限度减少污染的也许。24. 如果是药效实验,不建议你用手术标本，由于SFA的临床前研究指引原则上明确指出要用建株的肿瘤株进行实验，由于用手术标本的实验可反复性太差25. 一般用4-WK，体重15-17鼠，年轻鼠接种瘤容易长26. 种植肾被膜下：第一该区免疫豁免,第二贴近肾可以从此获得充足的养料.在实验时先用显微用的镊子在肾被膜上撕慨一种小口子,然后种植。注意：肾被膜和肾脏是有一种间隙可以用镊子在被膜下赶肿瘤组织到远离撕开口处,不用缝合被膜.这样就可以了27. 人肿瘤模型用裸鼠,基本上没有可成腹水的,只能皮下接种传代28. nude ic的数据在SCID mce上是比较有参照价值的,此外，由于免疫系统的进一步缺少，肿瘤生长的进程也许会比e mce上更快一点29. 接种后,用干净的棉签按住注射部位才拔针,拔针后再按住10秒种左右,一般不会有液体渗出30. K6第一代细胞接种的成瘤较好,传一代就很差了,没有几只成瘤的，到第三代就全军覆没31. 不赞同用70这个瘤株,国际公认度比较差32. 分组规定平行性,尽量缩小组间差别,组内差别是实际状况的反映。你可以按照肿瘤体积分层随机分组，这样平行性比较好33. 肿瘤细胞悬液裸鼠接种前稀释效果顺序:相应的无血清培养基PSsaln34. 目前常用的阳性对照药物是CTX和islain,此外乳腺癌可以用Taol。阳性药的剂量途径和疗程不规定和样品一致，但是给药途径尽量同样。尚有，最佳选用机制类似或者构造类似的阳性对照。一般来说阳性对照的克制率都会在60以上或者更大,少数状况下只有50左右。35. 细胞毒类抗肿瘤药物临床前体内实验一般至少应选用6种人癌移植瘤模型，其中应涉及I期临床实验中拟筛选的肿瘤组织类型。36. 针对每一种人癌移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率TC(%）作为实验评价指标,评价原则一般为:/C（%）40为无效;T/C（%） 40%,并经记录学解决P .05为有效。在体内有效性实验采用的所有人癌移植模型中，一般至少应有1/3达到有效原则。注解：对于/C40%，按照这个原则，诸多既有的一线化疗药物都会被裁减37. 适于接种的瘤源的直径最佳为1cm或者稍大一点,直径2cm也许对于有些瘤株来说会太大了一点。一般来说,插块法，一种瘤源接种3只动物是没有问题的,匀浆法一般只也可以接种30只了38. 新的抗肿瘤药物指引原则上强调要3代以上才干用,并且不能超过1520代(人肿瘤)。39. 只有少部分的小鼠实体瘤可以腹水传代,人实体瘤几乎没有可以腹水传代的40. 一般来说，小鼠肿瘤比较推荐路易斯肺癌和B16。国内的S180并不好,各实验室之间的变异很大。国外基本都不用它。其实并不是由于S180有多好人们才选用她，而是她进行实验的成本低,周期短，操作较容易41. 灌胃药溶解用生理盐水可以吗：不一定，根据混悬效果来看,一般多用.5-2%甲基纤维素钠（CMCNa）42. 实体肿瘤不可以采用生命持续时间这个指标,这个是明确有规定的43. 正常的实体肿瘤都是越长越大，最后也许会溃破,但是没有消灭这个现象，如果肿瘤整体的自发消灭,阐明模型有问题，最大也许是被污染了44. 出针挂组织的问题,核心在于针头的磨制,在针后部的小突起于小缺口吻合后，实体针弯曲方向应当与套管针磨制的斜面一致，接种时,实体针要推究竟,也就是背面的小突起与小缺口契合,然后针头“舔住”肌肉层转一圈再退针,尚有就是瘤块一定要完全塞入针头内,外面不能有漏出来的。45. S180、H22不需要测量肿瘤体积，实验结束后直接剥取肿瘤成瘤重46. 瘤株皮下成瘤率好,那么到了原位应当会更好47. 建议最佳流水线操作，保证每一种环节都是同一种人做究竟的，例如插块法，可以一种人切,一种人塞瘤块,一种人接种;比较忌讳每个人自己切自己塞自己接种，然后只做一部分的动物48. B16是小鼠黑色素瘤，宿主一般多用C57小鼠，由于这个肿瘤的细胞是黑色的,用它做肺转移,在白色的肺叶上是黑色的转移灶，很容易辨别。49. 在注射肿瘤细胞前对小鼠使用环磷酰氨或放射线照射,有助于移植瘤的生长50. 对于水不溶药物:低浓度的DSO的确是一种不错的解决手段，固然这样做进行报批是不可以被接受的，由于临床不容许这样的制剂血液给药,但是动物实验凑合可以，1%的浓度很低了，事实上,给小鼠(涉及裸鼠)尾静脉注射DMSO，5%如下基本没有任何反映，10%的时候需要较慢的速度注射，但是动物也可以接受,再高就不行了51. 瘤内注射:总注射量只能为瘤体积的1%，最多20%,瘤内注射有一定的技巧，我们就是用的4号针头,但是进针点要远一点，让针头在皮下多走一段，然后再刺入瘤内,一种肿瘤可以多点注射，但是一定要注意,刺入一点注射完毕后来，针头退出瘤组织，但是绝对不能退出皮下,然后换个地方再刺进去,一种点只能注射015l,不要多打,例如要注射20ul,就分两个点注射,每个点0l。52. 肿瘤模型一般常用的有小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型，此外尚有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型,其她的模型很少用53. 小鼠模型分三大类：a) 第一类：以10、EC、H2等为代表的,她们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水,也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水,通过一定稀释后皮下接种构建模型,接踵后第二天开始给药,给药7到天，接种0天后结束实验，剥取肿瘤称瘤重。i. 有关构建瘤种:可以用体外细胞株培养后,用BS悬浮至110/0.1ml/moe,i.接种即可，最佳用号左右的针头,就是常用的2ml一次性注射的针头。ii. 有关腹水传代:观测到第一代的种鼠肚子较大后(一般约89天左右），可以传代，传代时取1m注射器，用2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可,注意不要把针头插得很深,尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，运用重力，让腹水集中在某处便于抽取,一般抽个0l就可以了，不用离心,直接用PB36倍稀释后,接种到新的老鼠腹腔,腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的,但是血性腹水阐明不好,需要注意调节,第二代后来，尽量67天的时候传代,不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代后可用于实验。iii. 有关接种进行实验：这个时候抽取的腹水需要量比较多,一般需要处死种鼠后,小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤,注意不要弄破肌肉，然后,用镊子(最佳是那种前面有倒勾的镊子，学名仿佛是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一种小口,然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后通过一定的稀释后,接种到小鼠的腋下。有关稀释量,各个实验室的状况都不同样,最佳摸索一下,开始的时候可以合适的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下,但是不要进一步到腋窝里面,会给后来的操作带来麻烦。接种时的进针处离接种处远一点,让针头在皮下多走一段,不容易污染。有的人接种的时候喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往里走,然后注射的时候感觉阻力较大，打出来的皮丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连，不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉严重粘连。应当在两者之间，进针的感觉轻松自如,针头很自由,虽然打出来的肿瘤不会很圆很美丽，但是相对好剥取某些。iv. 有关观测指标:重要是准时称体重，实验结束后剥取肿瘤称瘤重。由于出瘤已经是接种后的第天左右了，第10天就结束时间,瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很难剥，这是没有措施的,只能耐心，没有太好的措施，剥多了后来,手上会掌握某些巧力,有某些协助,但是我们还是很头痛小鼠肿瘤实验结束。肿瘤组织周边常常会有某些血窦的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出，正常的,但是剥瘤子的时候不要把它弄破,会严重影响瘤重。按照FD的规定,平均瘤重不不小于g,或者单个瘤重不不小于20mg，觉得肿瘤生长不良，实验作废。b) 第二类：以les肺癌、6为代表的,她们的宿主多为C57。不产生腹水,只能皮下生长。多用插块法或者匀浆法传代和接种做实验。有一种做法也是接种后第二天开始给药，尚有一种做法是接种三天后给药,接种后两周结束实验，剥取肿瘤称重。i. 有关瘤种构建：体外细胞株，培养后PBS悬浮至13100.lsite,接种至小鼠腋下，即可。ii. 有关传代与接种:剥取肿瘤,在PBS中取出肿瘤表面包膜和中心的坏死部分，剪刀剪成小块,小块大小以套管针的针口为原则。用镊子将小块从针头处塞进820号的套管针,接种至小鼠腋下,用套管针中间的实体针将瘤块推出即可。 还可以在上述肿瘤组织剪成小块后，用玻璃匀浆器匀浆后,20目筛网过滤，收集滤液,活细胞计数,BS稀释后用注射器接种，稀释量也需要各个实验室自己摸索。也是三代后可用于实验。iii. 有关观测指标:可以在出瘤后测量瘤体积，但是重要还是考察瘤重。c) 第三类:以P38、L210为代表的白血病模型。宿主为DBA2，也有人用5与DBA2的F1代传代,DBA2用于实验,但是我们两种宿主都传过代，没有发既有什么区别。她们能形成腹水,一般不用于皮下接种实验,平时多用腹水传代，实验时多用腹腔接种或尾静脉接种考察生存时间。也是接种后第二天开始给药。这个就不细说了,诸多可以参照第一类，重要几点就是，她们的腹水都是血性的。此外，腹水量也不多，有的时候可以先注射一到两毫升的PS后,再抽取。54. 合成化合物或植物提取纯品的IC501 g/m1或植物粗提物的IC5020 g/1时,则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。55.