分光光度计使用方法

最佳答案1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热 10 分钟。 2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。） 3.根据所需波 长转动波长选择钮。 4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4 处，用擦镜纸 擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。 5.在暗箱盖开启状态下调节 零点调节器，使读数盘指针指向 t=0 处。 6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器， 使空白管的t=100,指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值， 并记录。 7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦 净分光光度计使用的外部环境要求分光光度计属于精密仪器，应当妥善保管和精心维护，这样才能保证分光光度计长期使用、 长期的稳定可靠、测量精度高。元析公司在多年的生产和应用的过程中，得到了一套在一定 环境下维护分光光度计的经验，具体如下：1、环境温度在条件容许的情况下，尽量保持在15-30 摄氏度之间，这样能保持电器件稳定 工作，不易老化，使分光光度计不易损坏，灯源的使用寿命得到延长。若条件不容许，在高 温的情况下，缩短开机时间，高效使用分光光度计，使电器件不要长期保持在高温下。在低 温下，使预热时间比常温下的预热时间要长，这样能保证在仪器稳定的情况下进行测试。2、环境湿度在条件容许的情况下，尽量保持在 60%以下，这样能保证光度计内部的光学件 和电器件不易受潮、腐蚀、和上霉。若条件不容许，在高湿度和低湿度的情况尽量保持通风。3、环境在条件容许的情况下尽量保持洁净，打扫环境时动作不宜太大，不要扬起灰尘，打 扫之前用防尘罩盖上分光光度计，不要让灰尘进入分光光度计内部。以上仅就仪器使用的外部环境作了描述，以供使用用户参考分光光度计的使用分光光度计的应用常识 分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓 度的定量。分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光 源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。 样品的吸光值与样品的浓度成正比。核酸的定量 核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双 链DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因 此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分 别相当于 50卩g/ml 的 dsDNA, 37卩g/ml 的 ssDNA, 40卩g/ml 的 RNA， 30卩g/ml 的 Olig。测 试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序， 输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。然而,实验并非一帆风顺。读数不稳 定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定 的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度1.0% (1A)。这样多次测试的结 果在均值1.0%左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的 缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使 用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE,可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不 可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的 存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于 0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着 样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素,如混合要充 分,否则吸光值太低,甚至出现负值；混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂 移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大；换算系数和样品浓 度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积 等多个操作事项。除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如 A260/A280 的比值，用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1&DNA) 或者2.0 （RNA）。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的 比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320 -般是0。蛋白质的直接定量（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样 品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简 单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最 佳的线性范围在1.0-1.5之间。实验中选择Warburg公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。 这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%,表明结果非 常稳定。漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光 值有少许改变,浓度就会被放大,从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试 较纯净、成分相对单-的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单； 但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法蛋白质定量 蛋白质通常是多种蛋白质的化合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨 酸,丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反 应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。比色方法一般有BCA, Bradford. Lowry等几种方法。Lowry法：以最早期的Biuret反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的 反应物。但是与Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应 试剂仮应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA, Triton x-100, ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。BCA （Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的 蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu + ,后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收 峰在 562nm 波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。 相对于 Lowry 法,操作简单,敏感度高。但是与 Lowry 法相似的是容易受到蛋白质之间以 及去污剂的干扰。Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应,产生的有色化合物吸收峰 595nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry和BCA两种测试方法的2倍；操作更简 单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干 扰Lowry, BCA反应的还原剂（如DTT,巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。 最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟 该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同 样品得出的样品浓度无可比性。例如:Keller等测试人奶中的蛋白，结果Lowry, BCA测 出的浓度明显高于Bradford,差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样 品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以BSA作标准 品，浓度1.34mg/ml,以a球蛋白作标准品，浓度2.64mg/ml。因此，在选择比色法之前， 最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色 法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差 距较大。关键问题是，反应后 1011 分光光度计的重要配件 比色杯的颜色是有一定的 半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在 此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液 PH 值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使 用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值 不准确。细菌细胞密度（OD 600） 实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较 高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生 物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了 保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实 验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间 后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌 悬浮状态。分光光度计的重要配件 比色杯 比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛 细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法 测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑 料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不 同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测 定的塑料杯,样品用量仅需50卩1,比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette? 塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学 的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微 生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。分光光度技术6.1 基本原理 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定 性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光 光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度 技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重点讨论紫外/可见分光 光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。1. 光谱：光是电磁波，可用波长“疋表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生 物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。九二 C/v入一波长C光速V频率，单位时间通过一个定点的波数。光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：E 二 h?vH普朗克常数（6.624x10-27尔格?秒）v频率紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm400nm。可见光区为 400nm800nm。组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转动、振动和分 子内电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分子的能量可以写成：E二E0+E平+E转+E振+E电E0是分子内在的不随分子运动而改变的能量，平动能E平只是温度的函数，因此与光谱有 关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子 处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。分子转动、振动和电子能级 的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸 收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级 间的能量差要符合下列关系：E二E2- E1二hE1、E2 分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的 光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不 连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的 能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，AE 0.05电子伏特（ev）,分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别 较大，E = 0.051.0 ev,振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大，E = 120 ev, 所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。可见光、紫外光吸收光谱,是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐 射能量形成的,即分子由基态变为激发态,电子由一个低能级的轨道（即成键轨道）,吸收 了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。与吸收光谱有关的三种电子是：二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键（即单键），称o键，构成键的电子 称o电子，如C C、C H键。平行于二个原子轨道形成的价键（即双键），称n键，形成n键的电子称为n电子，如 C二C 键。 未共享成键的电子，称n电子。 各种电子跃迁所需能量大小的顺序是： nn* nn* no* no* on* oo* 紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的n电子和未共享的电子对的激发所 产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的 共轭情况等。如下表所示：电子跃迁类型与紫外吸收波长（nm）关系表 电子跃迁类型 例 子 紫外吸收波长范围gg* C-H 100 150 nmnn*（非共轭）C = 0 104为强吸收； = 103104为较强吸收；750nm红外线光具有波粒二相性，波长不同，其能量不同。（二）物质的吸收光谱及颜色：1 物质的原子吸收光谱和原子发射光谱：原子的最外层电子可以选择性吸收特征波长的电磁波成为 激发态而产生的光谱称为原子吸收光谱。激发态原子恢复到基态，则释放出特征波长的光子，形成原子发 射光谱。不同的溶液其光谱不同，即不同溶液对不同波长的光其吸收能力不同，对某一特定波长的光存在 吸收峰。2 可见光由赤橙黄绿青兰紫等能量不同的光线组成，当可见光穿过某一溶液时，由于特定波长的光被吸收而使溶液呈现相应的颜色。（如CuSO4由于吸收了可见光中的黄光（600nm）而成蓝色）不同颜色 的溶液对不同波长的光其吸收能力不同。（三）光吸收的基本定律（Lambert-Beer定律）：束平行单色光（Io）通过有色的透明溶液时，一部分的光可以透过溶液（It）,另一部分被溶液吸收（la）, 还有一部分被器皿表面反射（lr）,则：lo=lt+la + lr。那么，该溶液透光率为:T = It / Io 。1 Lambert定律：设有一束平行单色光，通过液层厚度为b的均匀透明溶液，则溶液对光的吸收能力： A=lg（lo/lt）=lg（1/T）=k2bk2为吸光系数，为常数。与入射光波长、溶液性质、浓度和温度有关；A为吸光度（又称光密度O.D或消光度E）,当入射光波长、吸光溶液的浓度和温度一定时，A与b成正比。2 . Beer定律：设有一束平行单色光，通过浓度为c的均匀透明溶液，则溶液对光的吸收能力：A=lg（lo/lt）=lg（1/T）=k4ck2为常数。由Beer定律可知：当入射光波长、吸光溶液的厚度和温度一定时，A与c成正比。3. Lambert-Beer 定律：综合1.2.得： A=Kbc ,即：当入射光波长、吸光溶液的性质和温度一定时，A与b、c成正比。（四）吸光光度法的基本原理：1、不同物质，由于其分子结构和原子组成不同，故对光的吸收光谱不同（如：CuSO4），在测定不同颜 色的物质浓度时要用最大吸收的波长的入射光，这样测量的灵敏度最高。2、同种物质，若浓度不同，则对同波长的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比关系。3、 应此，利用特定波长的单色光（通常用最大吸收波长的入射光）照射不同浓度的某溶液时，所得的吸光 度大小应与溶液浓度呈线性关系，故可利用该线性关系通过计算或查标准曲线来求得未知溶液的浓度。（五）吸光光度法特点：1 .灵敏度高：mg%级、甚至ug%级。2. 准确度高：误差2-5%3. 操作简便、快速，仪器设备不复杂，价格低廉，故应用广泛。二 ：分光光度计的使用：（） 分光光度计的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱镜或光栅等分光器获得纯度较高的单色光 来测量未知溶液的浓度的方法。（二）常用分光光度计：可见光、紫外、红外分光光度计， 荧光分光光度计，火焰分光光度计等。（三）722 型分光光度计的结构（略）四） 722 型分光光度计的使用及注意事项1、插上插头，接通电源，打开暗箱盖，预热20min。* 注意：分光光度计在接通电源而不用时，必须打开暗箱盖，以免光电管老化。2、将准备好的试剂倒入比色杯中，用吸水纸擦去比色杯外侧水珠，并依次放入比色杯架中。* 注意：手拿比色杯毛面，试剂倒入杯中满2/3 即可，不得将比色杯放在仪器上。3、调节所需波长，灵敏度调至“1”，选择旋钮至“T”。4、调“0” ：打开暗箱盖，用调“0” 旋钮调节。5、调“100%” ：盖上暗箱盖，用调“100%” 旋钮调节，让光线通过“空白管” 。6、重复调“ 0” 和调“ 100%” 数次。* 注意：若调不到“0” 和“100%” ，可将灵敏度调至“2” 或更高，不得用力强行旋转旋钮，以免损坏。7、将选择选扭由“T”调至“A”，此时读数应由“100”至“0”，若不为“0”，可用“消光零”旋钮 调节。8、拉动拉杆，分别读取“ A 标” 和“ A 样” 。9、取出比色杯，弃去溶液，洗净晾干，备用。(五) 计算1利用标准管计算测定物含量：A样=样b样c样A标=标b标c标因为入射光的波长，溶液性质和温度以及比色杯的厚度都一样，即：K样=标b样=匕标所以：A样/ A标=c样/ c标得：c样=c标人样/ A标2 利用标准曲线进行计算：3 .偏离Lambert-Beer定律的原因1) 由于非但色光引起的偏离。2) 由于溶液本身原因引起的偏离： 由于介质不均匀引起的偏离 由于溶液中化学反应引起的偏离三：实验：CuS04浓度的测定C标=比色波长=650nm比色结果： A 标= A 样=计算：C样=。标*人样/A标仪器首页