高效液相实验报告

篇一：高效液相色谱实验报告高效液相色谱实验报告一 、实验目的1 了解液相色谱的发展历史及最新进展 2 学习液相色谱的基本构造及原理3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法， 能够通过 hplc 分离测定来对目标化合物的分析鉴定。 二 、实验原理 液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离 的目的。当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微 小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。液相色谱与气相色谱相比，最 大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在 已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。 高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸 点及热稳定性差的有机化合物。 80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析， 目前以已经广泛应 用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。三 、高效液相色谱的分类 吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色 谱法四 、高效液相色谱仪的基本构造 高效液相色谱至少包括输液系统、 进样器、 分离柱、 检测器和数据处理系统等几部分。 1 输 液系统： 包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。贮液装置用于存贮足够量、符合 hplc 要求的流动相。高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大， 因此需要高压泵输送流动相。2进样系统：将待测的样品引入到色谱柱的装置。液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证 柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。进样系统包括取样、 进样两项功能。 3 分离柱： 色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。商品化的 hplc 微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3 u m、5 u m、7 u m、以及10 u m。采用的固定相粒度甚至可以达到 1u m，而制备色谱所采用的固定相粒度通常大于10 u m。hplc填充柱效的理论值可以达到50000/m160000/m理论板，一般采用 100-300mm的柱长可满足大多数样品的分析的需要。 由于柱效内、外多种因素的影响，因此为使色谱柱达到其应有的效率。应尽量的减小系统的 死体积。 4 检测系统：hplc 检测器分为通用型检测器和专用型检测器两类。 通用型检测器可连续测量色谱柱流出物 （包括流动相和样品组分）的全部特性变化。这类检测仪器包括示差折光检测器、介电常数检 测器、电导检测器和磁光旋转检测器。这类检测器适用范围广，但是对于流动相有响应， 受温度变化、 流动相流速和组成变化的影响， 检测灵敏度低， 不能用于梯度洗脱的分离模式。 专用型检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，可用于测量被分离组分某类特性的 变化。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、放射性检测器。 5 数据处理系统：数据处理系统可以分为数据处理系统和专用智能处理系统两类，前者可以完成一般的色谱数 据处理任务，有些软件可以实现部分仪器的控制功能。前者即一般的色谱工作站，后者通常 称之为专家系统。五 、实验数据数据一：数据二：11 hplc 1六 、高效液相色谱的使用中的注意事项 流动相：1 、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时 注意区分水系膜和油系膜的使用范围；2、水相流动相需经常更换（一般不超过2 天），防止长菌变质； 样品：1 、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动 相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时， 进样体积应为定量管的 3 5倍；色谱柱： 1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书， 注意适用范围， 如 ph 值范围、流动相类型等； 2 、 使用符合要求的流动相； 3 、 使用保护柱；4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5甲醇 水溶液），再用甲醇冲洗。5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；6 、 不要高压冲洗柱 子；7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；篇二：分析实验报告高效液相色谱华南师范大学实验报告学号： 专业： 年级班级：课程名称：仪器分析实验实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯 实验时间：一、 实验目的 :1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法 2 、了解高效液相色谱的构造、 原理及操 作技术 二、 实验原理 : 高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相 色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速 分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异 （即由不同的分配系数） ， 当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的 分配系数只有微小差异， 随着液体流动相却可以有明显的差异， 最后使这些组分都得到分离， 通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。三、 仪器和试剂 :1. 主要仪器：岛津液相色谱仪 （lc-10at）配有紫外检测phenomenexo柱；10 u l微量注射器 2 、试剂： 甲醇、水苯和甲苯混合待测溶液 苯标准溶液： 2.0 u l/ml甲苯标准溶液： 2.0 u l/ml 苯、甲苯混合标准溶液： 1.0 u l/ml 、2.0 u l/ml 、5.0 u l/ml 、10.0 u l/ml 四、 实验步骤 1 、按操作规程开机。2、. 选择合适的流动相配比，优化色谱条件 通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。调好最佳色谱条件，控制流速为lml/min。柱温30 C,检测波长354nm 3、苯、甲苯定性分析在最佳条件下， 待基线走稳后， 用 10u l 微量注射器分别进样 10u l 苯和 甲 苯混合待测溶 液，10 u l苯标准溶液（2.0 u l/ml ）和10 u l甲苯标准溶液（2.0 ul/ml ）（ 微量注射器用甲醇润洗35遍），观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。4、苯、甲苯定量分析在最佳条件下，待基线走稳后，用10 U 1微量注射器分别进样1.0卩l/ml、2.0 ul/ml、5.0U l/ml 10.0 U l/ml的苯和甲苯混合标准溶液10 u l。观察并记录各色谱图上的保留时间和峰面积。绘制苯和甲苯混合标准溶液峰面积与相应浓度的标准曲线5 、苯和甲苯混合待测溶液分析 根据得到的苯和甲苯混合待测溶液的液相色谱图上显示的峰面积值，从绘制的标准曲线上查 出苯和甲苯混合待测溶液中苯和甲苯的各自的浓度。六、实验数据处理及分析 1 、色谱条件优化2.00色谱1.7570%1.501.251.000.750.500.250.00min分析：本次实验分别选择了甲醇：水 =60% ： 40% ， 70% ： 30% ， 80%： 20% 的溶剂配比，通过比 较不同溶剂配比条件下， 甲苯和苯的峰宽、 保留时间从而确定采用甲醇： 水 =80% ：20%作为本次 实验的最佳色谱条件。 2 、定性分析5.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0-0.5U min分析：在同一色谱操作条件和进样量下， 分别测定试样溶液中苯和甲苯组分及已知苯和甲苯 纯物质的保留时间，并将其色谱峰、保留时间与对应的已知苯和甲苯纯物质进行比较，两者 基本相同，从而确定混合样品中含有苯和甲苯。3 、定量分析苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为： 1 ul/ml, 2 ul/ml, 5 ul/ml, 10 ul/ml。4、未知样品浓度七、结果讨论1、实验中为什么采用标准曲线法作为定量的方法？答：因为实验中待测溶液的组分只有苯和甲苯两种物质， 组分比较简单。 只要在实验过程中 严格控制且定量进样，就能采用操作、计算简便的标准曲线法得出准确的实验结果。若采用 归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作、计算复杂，不能快 速分析，故实验中采用标准曲线法作为定量的方法。2在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液 - 液分配分离时： 首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短， 降低溶剂极性， 反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。3 选择流 动相时应注意的几个问题使检测器噪声增（ 1 ）尽量使用高纯度试剂作流动相， 防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和 加。（ 2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失； 酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。4）流动相同时还（ 3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。4影响分离的因素与提高柱效的途径1)液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途 径，降低固定相粒度可提高柱效。2)液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质； (恒温) 3 )改变淋洗液组成、极性是改 善分离的最直接的因素。 5. 高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：(1) 进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；(2) 流动相不同，在被测组分与流动相之间、 流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；(3) 由于液体的粘度较气体大两个数量级， 使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动 相中约小 45 个数量级；(4) 由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系， 满足梯度洗脱的需 要，因而提高了高效液相色谱的分辨率(柱效能)；(5) 高效液相色谱采用 510lm 细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩篇三：高效 液相实验报告化学与环境化学科学学院分析化学 骆洪伟 20144015016 高效液相实验报告一、实验目的1. 了解高效液相的实验原理。2. 学习并掌握高效液相色谱仪 (hplc) 的操作步骤。二、实验原理高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流 动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶 液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸 附解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内 流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。三、 hplc 的介绍及操作步骤 高效液相色谱仪主要包括高压输送系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统及 梯度洗脱等辅助装置。其工作流程如图 1 所示。 1. 高压输液系统 高压进样系统的作用是提供足够恒定的高压，使流动相以稳定的流量快速渗透通过固定相。高 压输液系统由贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置组成，其核心部件是高压泵，要求高压泵具有输出压力(1.5 X 1074.5 X 107pa),输出流量恒定(精度0.1ml min-1)，流量设定范围可调。梯度洗脱装置的作用是在分离过程中，按一定程序连续改变流动相中多种不同性质溶剂的配比,以改变流动相的极性、离子强度或酸度等,从而提高试样的分离效率,缩 短分析时间,使色谱峰形得到改善,提高测定的灵敏度和定量的准确度。此外,还附有加热 脱气、超声波脱气等装置,以排除溶解在流动相或试样中的气体。2. 进样系统在高效液相色谱中,一般采用旋转式六通阀于高压下进样。采用旋转式六通阀进样的优点是 进样量可变范围大,耐高压,宜于进样自动化,但易造成色谱峰柱前扩展。3. 分离系统 液相色谱柱一般采用内壁抛光的优质不锈钢管或厚壁玻璃管。为使工作压力不致过高,柱长 都比较短，一般在530cm，柱径为45mm。柱子的填充取决于柱填料的性能，对于生物胶 或离子交换树脂等,因遇到溶剂会膨胀,所以必须采用匀浆湿法填充。为防止颗粒大的填料 先沉降而产生分层现象，可采用等密度溶剂 ( 四氯乙烷和四氯乙烯混合物 ) 配成匀浆。用高压泵将其 快速压入装有流动相的色谱柱中，经冲洗后，即可使用。4. 检测记录系统 高效液相色谱检测器要求具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应快、死体积小等特点，且 对温度和流量的变化不敏感。目前，液相色谱常用检测器有紫外光度检测器、示差折光检 测器、荧光检测器和电化学检测器等。5.hplc 操作步骤(1) 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。(2) 对抽滤后的流动相进行超声脱气 10-20 分钟。(3) 打开 hplc 工作站 (包括计算机软件和色谱仪) ，连接好流动相管道， 连接检测系统。 (4) 进入 hplc 控制界面主菜单，点击manual ，进入手动菜单。(5) 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的 出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在 manual 菜单下，先点击 purge ，再点击 start ， 冲洗时速度不要超过 10ml min-1。(6) 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要 超过 2000 。点击 injure ，选用合适的流速，点击 on ，走基线，观察基线的情况。(7) 设计走样方法。 点击 file ，选取 select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击 new?method 。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测 器等，根据需要而不同。选完后，点击 protocol 。一个完整的走样方法需要包括： a. 进样前 的稳流，一般 2-5 分钟； b. 基线归零； c. 进样阀的 loading-inject 转换； d. 走样时间，随不 同的样品而不同。(8) 进样和进样后操作。选定走样方法，点击 start 。进样，所有的样品均需过滤。方法走 完后，点击 postrun ，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线， 洗掉剩余物。(9) 关机时，先关计算机，再关液相色谱。(10) 登记。 四、注意事项1. 泵的使用和维护注意事项为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：防止任 何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀， 因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用 millipore 滤膜(0.2卩m或0.45卩m)等滤器。泵的入口都应连接 砂滤棒(或片)。输液泵的滤器应经常清洗或更换。流动相不应含有任何腐蚀性物质， 含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓 冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞 等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶 剂(对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇 - 水)。 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封 环，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无 法正常工作。如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障： 没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵 在较大流量(如 5ml/min )下运转，将气泡排尽，也可用一个 50ml 针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要 排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内 有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分 堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸 （如 4mol/l 硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。 压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。 检查堵塞或泄漏时应逐段进行。2. 梯度洗脱 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须 充分重视：要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂 在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合 时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。梯度洗脱所用的溶剂纯度要求 更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂 中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止 混合时产生气泡。 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度 都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两 倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。 每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让1030倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。3. 溶剂过滤头的清洗取下过滤头放在 （1:4,v/v） 的硝酸溶液烧杯中超声清洗 15 分钟； 取出后用蒸馏水超声 清洗 10 分钟； 用吸球吹出过滤头中的液体； 再用蒸馏水超声清洗 10 分钟； 用吸球吹净过滤头中的水份； 将过滤头重新插入溶剂瓶中（ 正相系统注意将过滤头烘干 ） 。4. 流动相的更换 将新流动相置于储液瓶中； 打开放空阀，启动泵使新的流动相从入空阀出口流出20ml左右； 关闭放空阀，然后将进样阀与色谱柱相连接端卸开，用小容器放置于过样阀的出口处； 启动恒流泵，让流动相从进样阀出口流出10ml左右； 重新连接色谱柱， 设定适当流速， 当流动相流出约 30 倍于色谱柱体积， 并且检测器基线平 衡后，流动相更换完毕。