核酸的分离与纯化.ppt

1 第十章 核酸的分离与纯化 2 核酸 是分子生物学实验的主要研究对象， 许多分子生物学实验的第一步都要进行 核酸的提取，如 PCR、基因测序及分子 克隆等 . 提取核酸的 种类 :真核细胞基因组 DNA、 质粒 DNA、总 RNA及 mRNA 3 提取的核酸样品的完整性和纯度直接 关系到最后实验的结果 鉴定技术 : 分光光度技术 :样品定量、纯度鉴定 凝胶电泳技术 :样品定量、纯度鉴定 分子量测定 、分离核酸片段 4 第一节核酸分离与纯化的基本过程 一、材料与方法 1.材料：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞 2.方法： 保证核酸一级结构的完整性 原则 排除其他分子的污染，保证样品的纯度 5 二、技术路线 1.核酸的释放 破碎细胞，释放核酸 方法：机械法 破坏线性 DNA 非机械法 2.核酸的分离与纯化 大分子污染物 污染物 非需要的核酸分子 对后续实验有影响的溶液和试剂 6 3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤 浓缩 : 沉淀：有机溶剂沉淀法 原理： 洗涤：用 70 75乙醇去除沉淀中的盐 7 4、鉴定与保存 1.）核酸的鉴定 浓度、纯度、完整性 浓度鉴定 a 紫外分光光度法 260nm 在标准条件下， 1个吸光度单位相当于 50g/ml的双链 DNA 38g/ml的单链 DNA或 RNA 33g/ml的单链寡聚核苷酸 b 荧光光度法 荧光染料： 溴化乙锭 发出 橙红色 荧光 8 纯度鉴定 a 紫外分光光度法： 测 A260 A280的比值判断是否有蛋白质污染 （为什么） A260 A280比值为 1.8，纯 DNA A260 A280比值为 2.0, 纯 RNA b 荧光光度法：用溴化乙锭为染料示踪核 酸电泳结果判断纯度 9 完整性鉴定：用溴化乙锭为染料示踪核酸 电泳结果判断完整性。 2）核酸的保存 DNA的保存 pH 影响 DNA稳定性 pH7.08.0 EDTA 减少二价金属离子 氯仿 防止细菌污染 温度 低温 -70 保存数年 4 保存 10 RNA的保存 a 0.3mol L的醋酸钠或双蒸水， -70 -80 。若加入 RNA酶抑制剂可延长保存时间。 b 将 RNA沉淀溶于 70乙醇溶液或去离子的 甲酰胺溶液中， -20 可长期保存。 小量分装保存 11 第二节 基因组 DNA的分离与纯化 一、分离与纯化的方法 1.酚抽提法 : EDTA 裂解缓冲液 SDS 裂解细胞 蛋白酶 K RNA酶 pH8.0的 Tris饱和酚抽提 醋酸铵、无 水乙醇沉淀 70乙醇洗涤 DNA 12 13 2.DNA样品的进一步纯化 方法 : 透析、层析、 电泳 、选择性沉淀 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 14 二、 DNA片段的回收 (一 ) 原则与要求 1.提高 DNA片段的回收率 2.除去回收 DNA样品中的污染 (二 ) 回收方法： 1.DEAE纤维素膜插片电泳法 琼脂糖凝胶 2.电泳洗脱法 3.压碎与浸泡法 聚丙烯酰胺凝胶 15 第三节 质粒 DNA的提取与纯化 一、提取与纯化 基本过程： 细菌培养 细菌裂解 提取质粒 1.提取方法： 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法 2.纯化方法： 氯化铯 -溴化乙锭等密度梯度 超速离心法 （ CsCI-EB法） 聚乙二醇沉淀法 16 裂解细胞 细胞蛋白质、染色体变性 释放质粒 DNA 调 pH中性 质粒 DNA恢复天然结构 沉淀（质 粒 DNA溶于上清液中） 取上清液 无水乙醇沉淀质粒 DNA 70乙醇洗涤 质粒 DNA pH12.012.6 高浓度盐 17 18 二、质粒 DNA的回收 提取纯化的质粒 DNA 凝胶电泳 回收 19 第四节 RNA的分离与纯化 rRNA 8085% tRNA 1520% 总 RNA mRNA 15% mRNA 一、 RNA制备的条件与环境 RNase 注意： 1.细胞外 RNase的污染 2. 抑制细胞内 RNase 20 措施： 1.洁净的实验室 2.戴手套与口罩 3.一次性的实验材料和新包装的试剂 4.玻璃器皿用 DEPC处理 5.冰浴条件下进行操作 21 二、总 RNA的分离与纯化 （异）硫氰酸胍 -酚氯仿一步法 硫氰酸胍 +-巯基乙醇 裂解细胞 酚氯仿抽提裂解溶液 异丙醇沉淀 75乙醇洗涤 RNA pH4.0 22 三、 mRNA的分离与纯化 细胞内 mRNA特点：含量少 种类多 分子大小不一 mRNA结构特点：多聚腺苷酸尾（ polyA） 方法： oligo(dT)-纤维素柱层析法 oligo (dT)-纤维素液相结合离心法 23 24 第五节 DNA测序 主要方法 : 双脱氧末端终止法 Maxam-Gilbert化学降解法 DNA自动化测序 25 一、双脱氧末端终止法 原理： 模板：单链 DNA（ 待测序的 DNA） 酶：大肠杆菌 DNA聚合酶 引物： 5端标记的寡核苷酸链 底物： dNTP(AGCT) ddNTP(AGCT) 26 反应体系：四组独立的反应体系 每组均含有 dNTP(AGCT) ddNTP(一种 ) 操作： 1.获得标记片段组 2.电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.显影 4.读序 27 28 29 二、 Maxam-Gilbert化学降解法 待测 DNA标记 四组独立反应体系 针对某一种碱基进行切割 30 31 32 三、 DNA测序自动化 DNA自动测序仪，凝胶电泳、数据收集、 序列分析均自动化。 原理：四组反应体系均含有 dNTP和 ddNTP及一种荧光标记的引物，并且四组反应 体系的引物用不同颜色的荧光染料标记。 33