单分子知识点

光漂白(photonic bleaching)是在光照条件下使其发生化学反应或是构象改变， 而失去发荧光的特性,就是所谓的漂白 .它常用于生物体内扩散速率常数的测定. 光漂白抗性就是抗光漂白性吧我是这么理解的。下面的是搜索的关于绿色荧光蛋白八GFP的发光特性GFP吸收的光谱，最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光)； 发射光谱最大峰值为509nm(绿光)，并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder).GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧 光显微镜滤光片组合同样适用于 GFP 观察.尽管450490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强, 因此更适合于活体检测.GFP 的性质GFP荧光极其稳定，在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光 素(fluorescein)强,特别在450490nm蓝光波长下更稳定.GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重 新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP 荧光中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲 醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因 此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶 类报告蛋白.由于 GFP 荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因 此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法 比拟的 .常用的显微技术共聚焦显微镜原理：共焦显微镜Confocal Laser Seanning Microscope(CLSM 或 LSCM)在反射光的光 路上加上了一块半反半透镜(Beam Splitter),将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其 焦点上有一个带有针孔(Pin hole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增 管(photomultiplier tube, PMT)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系 统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处反射光强度。其 意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。共聚焦显微镜能提供无 比精确的三维成像，以及对亚细胞结构和动力学过程的精准测试。传统的光学显微镜使用的是场光源 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射 光的干扰;激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一 点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管(PMT)或 冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针 孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔， 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服 了普通显微镜图像模糊的缺点。共聚焦激光扫描显微(英文 Confocal laser scanning microscopy， CLSM, LCSM)是 一项高分辨率三维光学成像技术%主要特点在于其光学分层能力，即获得特定深度下 焦点内的图像。图像通过逐点采集，以及之后的计算机重构而成。因此它可以重建拓扑 结构复杂的物体。对于不透明样品，可以进行表面作图，而对于透明样品，则可以进行 内部结构成像。内部结构成像上，图像质量在单台显微镜中就可以得到极大的提升，因 为来自样品不同深度的信息未被重叠。传统显微镜能“看”到所有能被光投身到地方， 而对于共聚焦显微镜，只有焦点处的信息被采集。实际上共聚焦激光扫描显微是通过对 焦点深度的控制和高度限制来实现的。共聚焦的原理早在1957年就由美国科学家马文明斯基注册为专利，但实际上经 过三十年的时间及相应专用激光器的发展，直至1980年代末这项技术才成为标准技术。 1978年，托马斯和克里斯托弗克莱默设计出一套激光扫描程序叽该程序采用激光聚 焦的方式逐点扫描物体三维表面，并通过类似于扫描电镜的计算机化手段生成图像。这 一共聚焦激光扫描显微设计首次结合了激光扫描方法和荧光标记的生物样品三维探测。 接下来的数十年内，共聚焦荧光显微发展成一项成熟的技术，尤其受益于阿姆斯特丹大 (University of Amsterdam)，来自海德堡的欧洲分子生物实验童(EuropeanMolecular Biology Laboratory )及其业界伙伴的共同努力。全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescent microscope，TIRFM),利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性， 激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。因 为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降 低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。概念全内角反射荧光显微镜(total i nter nal reflection fluoresce nee microscope, TIRFM), 利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极 薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近 全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，能帮助研究者 获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观 察。2光学原理当一束光从光密介质进入光疏介质时，根据斯涅耳定律一部分光会发生折射，而一部分 光会发生反射，当入射角度不断增大，折射角也会不断增大，当折射角刚好达到90度时， 就发生了全反射现象。全反射发生后，折射光有一个临界状态沿着折射面传播，这部分光我 们称之为隐失波，其能量在Z轴上呈现指数衰减。、3技术分类TIRFM的实现是通过改变激光的入射角来实现的，按技术TIRF显微镜分为两种：棱镜 型和物镜型、棱镜型TIRF显微镜采用棱镜产生衰逝波，并用物镜收集荧光成像、物镜型 TIRF显微镜采用大数字孔径物镜产生衰逝波，同时采用物镜收集荧光成像、与棱镜型TIRF 显微镜相比，物镜型TIRF的应用更为广泛、近场光学显微镜近场光学显微镜是采用亚波长尺度的探针在距离样品表面几个纳米的近场范围进行扫 描成像的技术、如利用孔径在20-9Onm的近场探针在样品上进行扫描而同时得到分辨率高 于衍射极限的形貌像和光学像的显微镜、传统光学显微镜的分辨率受到光学衍射极限影响，分辨率不超过该波长尺度范围、与传 统光学显微镜不同的是，近场光学显微镜利用亚波长尺度探针，可以得到更小分辨率、 双光子激发显微镜双光子激发显微镜是一种荧光成像技术，对活体组织能达到很高的深度，最深可达1毫 米、作为多光子荧光显微技术的一种特殊形式，它使用能激发荧光染料的红移激发光线。每 一次激发，两个红外光光子都会被吸收、一方面，使用红外激发光线能减少光线在组织内的 散射；另一方面，多光子吸收背景信号会受到强烈抑制，因此这种成像方法能够达到如此的 深度、但是这种方法然受到衍射的限制、由于双光子激发显微镜具有更好的组织穿透能力, 更有效的光探测能力及更少的光毒性，在与共焦显微镜相比时显然是一个更好的选择、 单光子就是通常的荧光激发方式，一个光子激发一个荧光分子发光，荧光波长比激发波长稍 微长一些；双光子就是用两个光子激发一个荧光分子，激发光子能量小于荧光光子能量，因 此激发波长长于荧光波长、现在公认的双光子激发的用途：1.用于用到红外激发，穿透深 度要高于单光子激发，2.用于需要更高的激发功率，所以有效激发体积小于单光子激发， 分辨率稍高一些、主要的单分子荧光技术smFRET （单分子荧光共振能量转移）当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子 自身的荧光强度衰减。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为710 nm 时即可发生FRET;随着距离延长，FRET呈显著减弱。供体和受体之间FRET的效率， 可以由E=1/1+（R/R0）exp6反映，其中R表示供体和受体之间的距离，R0表示福氏半径， 依赖供体发射谱和受体激发谱的重叠程度，以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。1发生原理荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体Don or） 的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团 间的距离合适时（一般小于100A），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前 一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。简单地说，就是在供体基团 的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与， 所以是非辐射的，供体分子被激发后，当受体分子与供体分子相距一定距离，且供体和受体 的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一 部分或全部能量转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和 重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果受体也是一种荧光 发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。2发生条件能量供给体一接受体（D-A）对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括： （1）能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；（2）能量供体与能量受体的荧光生 色团必须以适当的方式排列；（3）能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转 移的几率才会高。此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干 扰能力等方面还有众多的要求。可见，要找到一个合适的D-A对是很不容易的。分子马达分子马达（molecular motor）,是美国康奈尔大学研究人员在活细胞内的能源机制启发下， 制造出的一种马达。这种微型马达以三磷酸腺苷酶为基础，依靠为细胞内化学反应提供能量 的高能分子三磷酸腺苷（ATP）为能源。肌球蛋白主要功能之一是使肌肉收缩。在非肌肉组织中维持细胞的弹性，以及 参与细胞质分裂。驱动蛋白以微管为轨道的动力蛋白，运动的极性由三磷酸腺苷水解酶（ATP水解 酶）活性域在蛋白一级结构中的位置决定。动力蛋白一般是以超分子集成体的形式存在，往微管的负极运动。乳糖操纵子E.coli的乳糖操纵子是原核生物基因表达调控的典型例子.1?乳糖操纵子的结构大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码B -半乳糖苷酶、透酶、乙 酰基转移酶，此外还有一个操纵序列0、一个启动序列P及一个调节基因1。1基因编码 一种阻遏蛋白，后者与0序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。在启动序列P 上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点，由P序列、0序列和CAP结 合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因 产物的协调表达。2?阻遏蛋白的负性调节在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，1基因列在P启动序列操纵下表 达的乳糖阻遏蛋白与0序列结合，故阻断转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有 阻遏蛋白与0序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子B半乳糖苷酶、透酶生成。当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催化、 转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数B -半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作 为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与0序列解离、发生转 录，使B -半乳糖苷酶分子增加1000倍。3?CAP的正性调节分解代谢物基因激活蛋白CAP是同二聚体，在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位 点。当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；当葡萄糖存在时，CAMP 浓度降低，CAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。由此可见，对乳糖操纵子来说CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。两 种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。4?对调节机制的解释大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低CAMP浓度，阻 碍CAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与O序列解聚，CAP结合CAMP后与乳糖 操纵子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。光镊原理编辑基本原理编辑介电质颗粒会吸引到光束聚焦点中心。作用于物体上力的大小与物体到光束中心的距离成正比， 就像弹簧系统。光镊可以通过高度聚焦激光束产生的力来操作纳米或微米级的介电质颗粒。高度聚焦激 光束通常是通过使激光通过显微镜物镜得到的。聚焦后的激光光束最窄的部分（光束腰 会存在非常强的电场梯度。介电质颗粒会被吸引至电场梯度最高的区域，也就是光束的 中心。同时，电场还会在光束传播方向上对颗粒产生力。这点可以通过动量守恒来理解。 光束中的介电质颗粒会吸收并散射光子，于是就会产生相应的动量的变化。如果颗粒不 在光束腰上，由于光场光强梯度（即不同区域的光强差异）的影响，颗粒各个方向上会 受到不均匀的力将其拉向光强最强的区域，如右图所示。光镊是非常精确的设备，可 以将亚微米级的颗粒移动亚纳米级的距离。所以，光镊常常被用于研究和操作DNA 蛋白质，酶甚至是单个分子。在定量科学测量中，通常电介质颗粒都会不移动到离光束中心很远的地方。当颗粒与光 束中心的距离很小时，颗粒受到的力与颗粒与光束中心的距离成正比。因此，其特性类 似于普通的弹簧系统，遵守胡克定律.光镊原理的细节编辑关于光镊原理的解释跟被作用颗粒的大小与使用激光波长的关系有关。当颗粒的大小比 激光波长大很多时，射线光学原理就可以解释光镊的原理。如果激光波长比颗粒尺寸大 得多时，颗粒就可以被当做是在光场中的电偶极子。当被作用物体的尺寸与激光波长在 同一数量级时，可以利用麦斯威尔方程组来解释其原理。射线光学解释编辑射线光学解释（未聚焦激光）。当颗粒偏离光束中心时（右图），由于光束中心的光强较大，动量 的转移造成对颗粒有一个指向光束中心的合力。当颗粒处于光束中心时（左图），颗粒受到的横向 合力为零。但是未聚焦的激光会对颗粒造成沿着光线传播方向的力。射线光学解释（聚焦激光）。聚焦的激光除了可以将颗粒困在激光的中心轴上，还可以将它困在光 轴上的特定位置：无论颗粒在激光聚焦点之前（左图）或之后（右图），动量的传递都会对颗粒产 生一个指向激光聚焦点的合力。因此，颗粒会被固定于聚焦点稍微偏后一点的位置。（稍微偏后是 因为颗粒会由于光的散射而受到沿着光传播方向的力）当被作用的目标尺寸比激光波长明显大很多时，光学捕捉现象可以使用射线光学来解 释。如图所示，激光中发出的光线进入和离开颗粒时会发生折射。因此，光线离开颗粒 时，其位置与其进入颗粒时相反。由于光子本身带有动量，这种方向的变化说明有动量 的转移。根据牛顿第三运动定律，就会有一个大小相等，方向相反的动量作用于该颗粒。 通常人们利用高斯光束来进行光学捕捉。在这种情况下，如果颗粒偏离光束中心，如图 右半部，由于光强较强的部分会比光强较弱的部分产生更大的动量转移而产生更大的 力，因此颗粒最后受到的合力是指向光束中心的。如果颗粒在光束的轴线上，进入颗粒 的光线会均匀地向周围散射，造成颗粒在横面上受到的合力为零。在这种情况下，颗粒 受到的合力是沿着光线传播方向的。轴向上，颗粒表面散射的产生的推力会与由于光场 强度梯度产生的梯度力抵消，造成颗粒稳定于轴线上束腰稍后一点的位置。荧光原位杂交（fluoresce nee in situ hybridizatio n, FISH是在 20 世纪 80 年代 末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记 取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子（reporter molecule）结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.FISH的基本原理是将 DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切 片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色 体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探 针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核同时 在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色 荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技 术.。原理FISH（fluoresce nee in situ hybridizatio n）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它 的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源 互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某 一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和 素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分 析。实验流程：FISH样本的制备一探针的制备一探针标记一杂交一（染色体显带）一荧光显微镜检测一结 果分析。特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探 针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点 是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。 采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体 系，有以下特点。荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术，研究膜蛋白和脂质平移扩散以及溶质通过质膜和在细胞内转运的一种技 术。包括三个步骤：荧光染料与膜成分交联；激光照射猝灭（漂白）膜上部分荧光；检测猝 灭部位荧光再现速率（由于膜成分的流动性）。荧光漂白后的恢复技术是将待测细胞用荧光物质标记，借助高强度脉冲式激光照射细胞的某 一区域，可以造成该区域荧光分子的光淬灭；通过低强度激光扫描成像，可以探测到该区域 周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率。由于光淬灭过程是不可逆的，荧光恢复过 程可明显的反映荧光标记物质及其结合物的运动。这个实验可以用来证明细胞膜具有流动性荧光光漂白恢复是用来测定活细胞的动力学参数， 借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的 非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探 测，因而可得到活细胞的动力学参数FLIP光漂白中的荧光损耗这是与FRAP（荧光漂白后的荧光恢复）相关的一个技术，对活细胞内有荧光的某个区域，用 强辐射以照明的方式进行反复光漂白。如果所有的荧光团都能扩散到被漂白的那个区域，在 一段时间后，这个过程会使得整个细胞的荧光信号完全损失。通过计算荧光从整个细胞消失 的速率，可以测定目标荧光团的扩散速率。什么是FRAP?FRAP （光漂白后荧光恢复）就是在光漂白后对样本确定区中的荧光恢复。FRAP是由没有 漂白的荧光团由周围进入漂白区FRAP的运动引起的。FRAP用于测量2-维或3-维分子运动的 力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。什么是FLIP?FLIP （光漂白中的荧光损失）是一个邻近重复漂白区的被定义区域内荧光的减少或消 失。与FRAP 一样，FLIP被用来测量膜或活细胞内分子运动的力度。FRAP原理在进行FRAP实验时，一个区域（如用荧光作标志的细胞表面）用低激光强度成像。因 此，高强度激励光脉冲被用来对定义的区域进行强烈漂白，如衍射限制点、小漂白ROI、视 场内平行光带的直线型。最后，在漂白区域的恢复时间过程采用模糊激励激光束来监控。结果是，FRAP说明任何类型的荧光分子运动（被动的，如扩散；积极的，如移动。） 恢复时间（半恢复时间）表明了这种移动性，如扩散时间的速度。