疾病相关SHP2突变体的相分离是MAPK过度活化的基础

疾病相关SHP2突变体的相分离是MAPK过度活化的基础导读非受体蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP） SHP2是由PTPN11编码的，在正常发育RAS-有丝分裂原-活化的 蛋白激酶（MAPK）信号通路中发挥重要的作用。令人费解的是PTPN11酶活化和失活的突变体为什么 能够导致具有重叠临床表现的人类发育紊乱。在本研究中，研究者发现一种常见的、在这些疾病相关 的SHP2突变体中共有的液-液相分离（LLPS）行为。SHP2 LLPS是由保守的、折叠良好的PTP结构域通 过多价电子相互作用介导，并且通过构象的改变由一种内在的自体抑制机制调节。SHP2变构抑制剂 能够减弱SHP2突变体的LLPS，提高SHP2 PTP的活性。此外，疾病相关SHP2突变体能够招募和激活 LLPS中的WT SHP2，促进MAPK的活化。这些结果不仅暗示LLPS以一种功能获得的方式参与SHP2相 关人类疾病的发病机制，也提供证据说明PTP受LLPS调节，LLPS可能作为治疗的靶向。实验设计ClosedOpenClosedO SHP2-WT结果1疾病相关SHP2突变体在细胞中形成离散的点为了探究疾病相关突变体如何影响SHP2细胞内的功能，研究者在KYSE520细胞中稳定表达了 6个mEGFP标记的SHP2突变体 （1个WT, 3个NS/JMML突变体，以及2个NS-ML突变体）， 该细胞系是一种依赖SHP2的食道癌细胞系。SHP2-mEGFP的表达水平与内源性SHP2具有可比 性。重要的是，活细胞荧光显微镜发现所有与疾病相关的SHP2突变体都形成了离散的斑点，而SHP2 WT在整个细胞中明显散布（图1A）。高内涵成像分析显示疾病相关SHP2突变体不仅在数量上，在斑点的平均大小上也超过了SHP2 （图1B）。在SHP2突变体中斑点的数量与平均斑点大小相关。此外，在一些其他细胞系中，包括HEK293T, A549,以及HUVEC，利用mEGFP-或者mScarlet-标记的SHP2进行的实验中也观察到相似的突变体特异的斑点形成。为了排除 所观察到的斑点形成可能是由于外源性SHP2表达导致细胞内蛋白浓度升高，研究者进一步在SHP2敲除的HEK293T细胞中稳定表达了 mEGFP-标记的SHP2突变体和WT。SHP2-mEGFP蛋白的 表达水平与亲代HEK293T细胞中SHP2的表达水平相同。研究者再次观察到SHP2突变体中形成 斑点，而SHP2中没有。值得主要的是，两个癌细胞系H661和CCF-STTG1都分别含有一个内源性NS相关的SHP2 或者NS-ML相关的SHP2 突变体，也出现了 SHP2斑点，而含有两个WT SHP2等位基因的KYSE520 经免疫荧光检测只是偶尔有SHP2斑点。研究者进一步在更多生理设置的条件下检测了SHP2斑点的存在，结果发现在Ptpn11小鼠源性的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)以及Ptpn11 小鼠源性的间充质干细胞(MSCs)中SHP2斑点的数量具有高度的统计学意义，而在WT MEFs或者MSCs中没有发现斑点(图1C、D、E、F)。在分别含有一个SHP2或者一个SHP2突变体的NS病 人口腔黏膜细胞中发现了大量SHP2斑点，但是在两个健康的捐赠者中却没有(图 1G、H)。 这些结果清楚的说明在细胞内疾病相关SHP2突变体具有更高的斑点形成倾向。ANSuJMIMLMutaticiFiw NS-ML MulatngS|_|p2wrSHPZ% 缶SHP2E7EA SHP2F70|SHP2=79C SHP2R4；adLLeJUJE，ZO.HIZIF图1.细胞内疾病相关SHP2突变体形成斑点。(A) KYSE520细胞中SHP2以及SHP2 -mEGFP的活细胞成像， 标尺为10 mm； (B) SHP2以及SHP2 -mEGFP斑点高内涵数据定量，*p 0.001 ； (C) Ptpn11 以及对照小 鼠源系MEF细胞中SHP2免疫荧光成像，标尺10 mm； (D)对图C结果进行定量分析，*p 0.001 ； (E) Ptpn11 以及对照小鼠源系MSCs细胞中SHP2免疫荧光成像，标尺10 mm； (F)对图E结果进行定量分析，*p 0.001； (G)两个努南综合征患者和两个健康个体源系口腔黏膜上皮细胞中SHP2免疫荧光成像，标尺10 mm； (H)对图G结果进行定量分析，*p 0.001。细胞内疾病相关SHP2突变体的斑点表现出液滴样的特征LLPS已经成为许多生物学过程中一种基础的调节机制。研究者评估了 SHP2突变体斑点是否具有任意液滴样特征。结果发现 NS/JMML和NS-ML SHP2突变体的确形成斑点，斑点能够移 动并且一旦相遇就自发融合（图2A）。光漂白（FRAP）后的荧光恢复实验说明一旦光漂白，SHP2-mEGFP突变体斑点的免疫荧光在几分钟内就恢复（图 2B、2C）。为了证实内源性SHP2突变体 形成的斑点在活细胞中是否具有液滴样的特征，研究者利用CRISPR-Cpf1对H661细胞中带有mEGFP的内源性SHP2突变体等位基因进行标记，随后进行单克隆扩增并且通过测序进行验证。 在加工H661细胞的SHP2 -mEGFP中观察到与亲代H661细胞内源性SHP2 一样的浓缩形成。 在加工H661细胞中内源标记SHP2 -mEGFP的斑点通过FRAP实验也证实具有浓缩的流动性（图 2D）。这些结果提示促进斑点形成的 NS/JMML和NS-ML SHP2突变体也表现出动态的液滴样行 为。图2.细胞中疾病相关SHP2突变体的斑点表现出液滴样特征。（A）两个SHP2 -mEGFP斑点的融合，标尺5 mm；（B）KYSE520细胞中对SHP2E76K -mEGFP 进行FRAP实验的代表性图像，标尺 5 mm；（C）SHP2 -mEGFP斑点的FRAP数据定量分析；（D）H661（SHP2N58S）细胞中对内源性标记SHP2-mEGFP进行FRAP实验的代表性图像， 标尺10 mm。3 疾病相关SHP2突变体能够促进体外SHP2的LLPS研究者进一步探究了体外SHP2是否具有相分离的能力。研究者准备了重组WT和多个疾病 相关的SHP2突变体蛋白，结果发现相较于SHP2 WT，NS/JMML和NS-ML突变体形成液滴的能力 更强（图3A、B）。显著的是，SHP2突变体在体外形成液滴的潜能与细胞内形成斑点的能力相 关（图3C）。SHP2突变体的液滴在一段时间内倾向于结合（图 3D）。此外，FRAP实验说明当 进行光漂白实验时，SHP2-mEGFP突变体液滴中的荧光能够有效的恢复（图 3E），进一步证实 SHP2突变体在体外进行典型的LLPS。研究者通过进行不同浓度SHP2突变体和氯化钠的液滴形成实验建立了SHP2 WT和两个疾病相关突变体SHP2和SHP2 的相图。研究者观察到在接近细胞内生理盐水浓度125mMNaCl存在时，SHP2 和SHP2 能够从0.25-0.5 mM开始进行LLPS，而SHP2 WT的LLPS从2-4 mM 时开始出现（图3F）。研究者随后在多个细胞系中检测了内源性SHP2的蛋白浓度，结果发现细胞内SHP2蛋白的浓度大约在0.3-0.4 mM。假设SHP2突变发生在PTPN11的一个等位基因上， 内源性SHP2突变体的浓度（0.15 -0.2 mM）接近体外SHP2突变体LLPS所需要的临界浓度（图 3F）。然而细胞内SHP2 WT的蛋白浓度低于体外SHP2 WT LLPS所需要的临界浓度。这一发现帮助解释了为什么细胞内SHP2突变体倾向于形成斑点，而SHP2 WT并没有（图1A）。总之这 些结果说明了体外细胞内疾病相关SHP2突变体和SHP2 WT差异的LLPS行为。ANS/JMMLMutationsNS-ML Mutaticns$HpqwrSHP2W1G SHP2ET&A=一富 &d1_lU5HP2-E76KSHP2R4.98LSHP2-WTPteri MflceiMralig inMnB- 421 Q5 Q2$Q12& 00 oooo ooooo5 姬盅必苻数 -u EnfiKFSi-unzPrettin cofttwnfraBwi 仲 iS Z 1 05 口踌 S网i ooo如。图3. 疾病相关SHP2突变体促进体外SHP2的LLPS （A）在10% （w/v） PEG3350存在时，8 mM重组SHP2 以及SHP2 -mEGFP蛋白液滴形成的代表图像，标尺 5 mm；（B）OD600对SHP2以及SHP2mu-faEGFP的液滴形成 进行量化，*p 1=$2巫含占upannaaa of SHP2 mutantsR1 0.9175V27KR49flLE76KCLOSEDSingle Molecule FRET.ouao8 ionOLc.SHPW子 ICM E Tflrol 杀 5(hM ETEDOMSOCLOSED 1|jM peptide1iaMpplid图4 .开放构象促进SHP2的LLPS o（ A）代表性的疾病相关SHP2突变体，NS/JMML突变体（蓝色）以及NS-ML （绿色）；（B）代表SHP2和指定SHP2固有开放构象的体系；（C）体外LLPS能力与SHP2突变体开放性的 相关性；（D）在10% （w/v） PEG3350存在下重组SHP2 -mEGFP蛋白液滴的代表性成像，标尺5 mm； （E）图示说明变构抑制剂SHP099将SHP2封锁在一个关闭的构象中；（F）单分子FRET结果展示SHP099导致 SHP2E76A-87/266的构象变化；（G和H）展示利用SHP099和ET070处理SHP2液滴，OD600测定液滴浑浊度的 时间轨迹；（I和J）利用SHP099和ET070处理稳定表达SHP2 -mEGFP的KYSE520细胞，I图对斑点/核进行定 量，J图展示了 SHP2 - mEGFP的成像结果；（K） bis-P肽段与SHP2结合的卡通图；（L）利用w/o （有或无）1mM bis-P肽段处理SHP2 蛋白，并且测定液滴的浑浊度， *p 0.001 ；（M） DMSO或者1 mM bis-P肽段处理SHP2液滴的成像结果，标尺 5 mm。5 PTP结构域能够驱动静电相互作用介导的SHP2 LLPS研究者接下来探究了 SHP2相分离的分子基础，与大多数进行LLPS的蛋白不同，SHP2并不 包含低复杂度的IDRs或者重复的多价模域。为了鉴定负责SHP2 LLPS的结构域，研究者准备了重组全长 WT SHP2 （FL-SHP2）以及三个截断体 SHP2（SHP2DC, N/C-SH2, SHP2-PTP） （图 5A）。 值得注意的是，相对于FL-SHP2和其他突变体，催化的PTP结构域LLPS的能力更强（图5B、 C）。通过融合实验发现SHP2-PTP的液滴发生融合。有趣的是，变构抑制剂SHP009能够有效的减弱全长SHP2突变体的LLPS，但是不影响SHP2-PTP的液滴形成。因为PTP结构域的表面包含一些负向和正向的补丁，研究者接下来检测了静电相互作用是 否参与调节SHP2 LLPS。的确，SHP2-PTP的液滴形成对NaCl浓度升高高度敏感（图5D）。为 了进一步查明调节SHP2-PTP LLPS的关键电荷补丁，研究者构建了分布在SHP2-PTP表面不同电荷补丁的17个SHP2突变体，包括16个双突变和1个单突变。研究者发现6个突变体 （R362E/K364E, E523K/D437K, E447K/E481K, E441K/D437K, E447K/D451K, R265E）能够显著降低 SHP2-PTP 液滴形成。其中 E523/D437, E447/E481, E441/D437, E447/D451 突变体分布在两 个负电荷的补丁（ NCPs）上，而R362/K364以及R265坐落在两个正电荷的补丁（ PCPs）上。 这些结果表明SHP2-PTP蛋白表面的多个NCPs和PCPs调节SHP2-PTP LLPS分子间静电相互作 用。不同电荷的补丁中，包含R362/K364的补丁可能发挥主导作用，因为 R362E/K364E突变体 在不干扰整体结构或者PTP活性的情况下能够消除SHP2-PTP LLPS的能力（图5E、F）。重要 的是，引入疾病相关SHP2突变体，R362E/K364E突变体能够整体地消除细胞内不同 SHP2突变 体的斑点形成（图5G）。图5. PTP结构域驱动静电相互作用介导的SHP2 LLPSo (A)全长SHP2以及截断体SHP2 (SHP2AC, N/C-SH2以及SHP2-PTP) 的图示；(B)在 10% (w/v) PEG3350 存在时 8 mM FL-SHP2、SHP2AC, SHP2-PTP、N/C-SH2 的代表性成像，标尺 5 mm；(C) 在 LLPS 缓冲液(10% (w/v)PEG3350)中对 8 mMFL-SHP2、SHP2K SHP2-PTP、N/C-SH2 液滴浊度的定量，*p 0.001；(D) 在指定浓度NaCl中SHP2-PTP形成液滴的代表性成像，标尺5 mm； (E)图示说明R362E/K364E突变体在 SHP2-PTP(PDB: 4DGP)表面将正电荷转变为负电荷；(F) PTP和PTPR362E的显微镜图像，标尺为5 mm； (G) KYSE520 细胞中特定突变体SHP2-mEGFP的显微成像，标尺为10 mm。c-OMaQs豆 q 与二J!d 口占6 LLPS刺激SHP2 PTP活性，对于SHP2突变体诱导的ERK1/2过度活化是必不可少的 SHP2是RAS-MAPK信号通路中关键的正向调节因子 。由PTPN11突变体导致的NS和NS-ML综合征属于一个新分类的常染色体显性综合征家族，被称为“RASopathies ”。研究者发现在细胞中稳定表达的NS和NSML突变体SHP2,而不是SHP2能够提高MEK1/2和ERK1/2的磷酸化 水平(图6A)。值得注意的是，尽管 LLPS缺陷的R362E/K364E突变体对SHP2 PTP活性没有 影响，它们能够减弱疾病相关SHP2突变体诱导的ERK1/2活化(图6B、C)，表明疾病相关SHP2 突变体的LLPS对于ERK1/2的过度活化是至关重要的。考虑到LLPS能够在凝结物中局部浓缩分子加速反应，研究者接下来检测了LLPS是否能够促进SHP2的PTP活性。的确，酶学实验发现在 LLPS条件下SHP2突变体的液滴表现出更稳健 的PTP活性，相较于对应突变体在溶剂条件下(图 6D)。DiFMUP去磷酸化的产物(DiFMU)，是 SHP2体外合成的底物，在SHP2液滴中浓缩(图6E)，提示在相分离的凝集物中SHP2 PTP活 性升高。Activity图6. LLPS刺激SHP2 PTP的活性并且在SHP2突变体诱导的ERK过度活化中必不可少。（A）对稳转SHP2 以及SHP2 HEK293T细胞中指定蛋白进行免疫印迹；（B）对稳转指定SHP2突变体HEK293T细胞中指定蛋白进行免疫印迹；（C）对B中pERK/ERK水平进行光密度检测，*p 0.05; *p 黑&旬0:SHP2*mEGFP 十 SHP-mSearlef图7. SHP2突变体的LLPS招募和活化SHP2进而促进ERK1/2的活化。（A）对瞬时转染表达质粒HEK293T细 胞中的指定蛋白进行免疫印迹；（B和C）在瞬时转染SHP2和SHP2 质粒的HEK293T细胞中进行免疫印迹（图B），并且对pERK/ERK的水平进行光密度检测分析（图 C）； （D）代表性成像显示SHP2WT-mEGFP分布在SHP2 -mScarlet液滴中，标尺为2.5 mm； （E）在LLPS条件下，以对硝基苯磷酸盐（pNPP）为底物的溶液中对 指定蛋白的酶活性进行检测，*p 0.001 ； （F）对共转染SHP2 -mEGFP以及SHP2 -mScarlet KYSE520 细胞的活细胞成像，标尺为10 mm； （G）卡通图说明SHP2诱导强LLPS招募SHP2并促进ERK激活。结论研究者证实NS/NS-ML以及癌症相关的SHP2突变体获得了 LLPS的能力，促进了 PEP的酶活性。SHP2 的LLPS是由保守的、折叠良好的PTP结构域通过分子间静电相互作用并且经历分子间构象的调节驱 动的。疾病相关SHP2突变体能够在相分离凝集时招募WTSHP2,并且促进RAS-MAPK信号通路。此外， SHP2变构抑制剂能够减弱SHP2突变体的LLPS。研究者发现LLPS在SHP2相关人类疾病的发病机制中 提供了一个GOF机制，可能在人类疾病的治疗中应用靶向LLPS治疗。