Galectin―9蛋白过表达对卵巢癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响9900字

Galectin9蛋白过表达对卵巢癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响9900字 摘要 目的 探?半乳糖凝集素-9（Galectin-9）蛋白过表达对卵巢癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。 方法 将卵巢癌细胞SKOV-3分为转染pcDNA3.1-Galectin-9组、pcDNA3.1组和空白对照组，通过Western blot检测Galectin-9蛋白的表达，CCK-8检测Galectin-9蛋白对SKOV-3增殖能力的影响，划痕试验验证Galectin-9对SKOV-3迁移能力的作用，Annexin-V-FITC/PI双染法检测Galectin-9蛋白对SKOV-3凋亡的影响。 结果 Western blot结果显示，转染pcDNA3.1-Galectin-9组Galectin-9蛋白表达明显高于空白对照组和pcDNA3.1组，差异均有高度统计学意义（均P 0.01）；CCK-8结果显示，转染pcDNA3.1-Galectin-9组增殖能力明显低于空白对照组和pcDNA3.1组，差异均有高度统计学意义（均P 0.01），Galectin-9能显著抑制细胞的增殖能力，并且抑制细胞的增殖能力随着时间的延长而增强；细胞划痕试验结果显示，转染pcDNA3.1-Galectin-9组的愈合率明显高于pcDNA3.1组和空白对照组，差异均有高度统计学意义（均P 0.01）；流式细胞试验结果显示，转染pcDNA3.1-Galectin-9组的凋亡率明显高于pcDNA3.1组和空白对照组，差异均有高度统计学意义（均P 0.01）。 结论 Galectin-9的过表达能够抑制卵巢癌细胞株的增殖和迁移能力，并促进其凋亡。 毕业关键词 半乳糖凝集素-9；卵巢癌；细胞增殖；细胞迁移；细胞凋亡中图分类号 R737.31 文献标识码 A 文章编号 1673-7210（2018）01（c）-0013-04Abstract Objective To investigate the effects of overexpression of galectin-9 on the proliferation， migration and apoptosis of ovarian cancer cells. Methods The ovarian cancer cells SKOV-3 were divided into pcDNA3.1-galectin-9 transfection group， pcDNA3.1 group and blank control group， Western blot was used to detect the expression of galectin-9 protein， CCK-8 was used to detect the effects of galectin-9 protein for multiplication capacity of SKOV-3， scratch test was used to verify the effects of galectin-9 protein for transfer ability of SKOV-3， Annexin-V-FITC/PI double staining method was used to detect the effects of galectin-9 protein for apoptosis of SKOV-3. Results The results of Western blot showed that the expression of galectin-9 protein in pcDNA3.1-galectin-9 transfection group was significantly higher than those in blank control group and pcDNA3.1 group， the differences were all highly statistically significant （all P 0.01）. The results of CCK-8 showed that the multiplication capacity of galectin-9 in pcDNA3.1-galectin-9 transfection group was significantly lower than those in blank control group and pcDNA3.1 group， the differences were all highly statistically significant （all P 0.01）， galectin-9 could significantly inhibit the multiplication capacity of cells， and the capacity of inhibiting proliferation would increase with the extension of time. The results of cell scratch assay showed that the healing rate of pcDNA3.1-galectin-9 transfection group was significantly higher than that of pcDNA3.1 group and blank control group， the differences were all highly statistically significant （all P 0.01）. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of pcDNA3.1-galectin-9 transfection group was significantly higher than that of pcDNA3.1 group and blank control group， the differences were highly statistically significant （all P 0.01）. Conclusion The overexpression of galectin-9 can inhibit the proliferation and migration of ovarian cancer cell lines and promote its apoptosis. Key words Galectin-9； Ovarian cancer； Cell proliferation； Cell migration； Cell apoptosis卵巢癌为妇科常见的恶性肿瘤之一，具有侵袭性强、恶性程度高、转移快、病死率高和复发率高等特点1，半乳糖凝集素-9（Galectin-9）是半乳糖凝集素家族成员之一，具有嗜酸性粒细胞趋化作用及抗肿瘤功能，在多种恶性肿瘤组织中呈低表达。文献报道，通过免疫组织化学发现，Galectin-9存在于宫颈上皮内瘤变组织和宫颈癌中，且宫颈癌中的表达水平明显低于宫颈上皮内瘤变组织2-3；同时Galectin-9的低表达促进了食管癌细胞ESCC的侵袭和迁移，参与了食管癌的发生、发展过程；在卵巢癌组织中Galectin-9阳性表达率低于癌旁组织和良性卵巢组织，且与卵巢癌的发生及淋巴结转移密切相关4；但Galectin-9对卵巢癌细胞的作用还未明确，因此本研究通过体外研究探讨Galectin-9对卵巢癌细胞系（SKOV-3）增殖、迁移和凋亡的影响，阐明其在卵巢癌发生、发展中可能的作用机制，为卵巢癌的靶向治疗提供新的理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂人卵巢癌SKOV-3细胞株由青岛大学医学院附属青岛市立医院肝胆胰细胞实验室提供；RPMI 1640培养液（批号：AB10113944）购自美国HyClone公司；胎牛血清（批号：11F289）购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；青链双抗（批号：20161019）购自美国Hyclone公司；CCK-8（批号：20170206）和膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin-V-FITC/PI）（批号：A005-3）购自上海七海生物科技有限公司；Galectin-9蛋白购自美国Cayman Chemical公司；Galectin-9过表达质粒和空载质粒由上海生物工程技术服务公司构建和提供，脂质体Lipofectamine 2000（批号：11668019）购自美国Invitrogen公司；SDS-凝胶配制试剂盒（批号：P0012A）、RIPA裂解液（批号：P0013C）、蛋白酶抑制剂（批号：P1005）和PVDF膜（批号：FFP24）购自上海碧云天生物技术有限公司；单克隆抗体羊抗人Galectin-9抗体购自英国R&D Systems，Abingdon公司；单克隆抗体鼠抗人肌动蛋白（-actin）（批号：ab8226）购自美国abcam公司；单克隆山羊抗兔抗体（辣根过氧化物梅标记）（批号：BL003A）、单克隆山羊抗鼠抗体（辣根过氧化物梅标记）（批号：BL003B）均购自美国CST公司。1.2 SKOV-3细胞的培养SKOV-3细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于培养箱（37、5%的CO2）中进行培养。根据细胞生长状况，每2天左右进行1次换液，当细胞覆盖瓶底80%左右时，以0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，以12传代培养。实验选用生长状态良好的第24代细胞。1.3 细胞转染及筛选将SKOV-3细胞以3105/孔的密度接种于6孔板中，每组设6个复孔，当细胞覆盖瓶底80%左右时，按照LipofectamineTM 2000脂质体说明书转染pcDNA3.1-Galectin-9组及pcDNA3.1组，每孔脂质体5 L、质粒2.5 g。通过梯度试验确定顺铂对SKOV-3细胞的最佳筛选药物浓度为15 mg/mL，转染24 h后，将6孔板中的细胞消化，并以110的比例接种于24孔板中，于转染24 h后加入顺铂。隔1 d换1次筛选培养基，筛选1周，转移至25 cm2培养瓶中扩增培养。同时设置未进行转染操作的空白对照（空白对照组）。1.4 Western blot检测Galectin-9蛋白的表达实验分组同“1.3”。取三组对数生长期细胞各1瓶，用含有蛋白酶抑制剂的裂解液提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度。取等量蛋白样品（40 g）进行电泳，并转移至PVDF膜上。用含有5%脱脂奶粉室温封闭2 h，弃去封闭液，分别加入用5%BSA的TBST稀释的一抗（Galectin-9 15000；-actin 12000），4过夜。一抗孵育结束后，TBST洗涤，然后分别用HRP标记的山羊抗兔IgG（12000）和HRP标记的山羊抗鼠IgG（12000）室温孵育2 h，TBST充分洗涤后，电化学发光显影。实验重复3次。1.5 CCK-8检测Galectin-9对细胞增殖的影响分别取三组对数生长期细胞，胰酶消化后接种于96孔培养板（5103个细胞/孔）中，每孔加入200 L培养基，每组设12个复孔，继续培养24 h，使细胞贴壁。按照CCK-8试剂盒提供的步骤分别检测0、12、24、36 h和48 h的细胞增殖能力。1.6 划痕试验检测Galectin-9对细胞迁移的影响?验分组同“1.3”。同样分别取三组对数生长期细胞，每组设3个复孔，分别转移到培养皿中，在低血清培养基中培养细胞贴壁且达到80%融合时，换无血清培养基培养，在培养皿中划一条线性刮痕，用PBS洗涤细胞3次后将细胞继续孵育（37，5%CO2），并在诱导刮伤后0、12、24 h后使用显微镜获得图像。划痕愈合率=（划痕后的即刻面积-划痕后12 h或24 h的愈合面积）/划痕后的即刻面积100%。划痕愈合率越高，表明细胞的迁移能力越强。采用Image-Pro Plus 6.0软件处理。1.7 Annexin-V-FITC/PI双染法检测Galectin-9蛋白对细胞凋亡的影响实验分组同“1.3”。取三组生长状态良好的接近融合的细胞，等量接种于6孔板中（2104/孔），每组设3个复孔，当6孔板细胞长到80%左右时，按照Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书进行操作。每组样品分别加入400 L结合缓冲液，5 L Annexin V，混匀，室温避光孵育15 min，然后加入10 L PI，混匀，冰浴避光孵育5 min，在30 min内进行流式细胞仪检测。用CELL Quest软件对结果散点图进行分析，获得由4个象限组成的细胞直方图，每个象限的细胞数目就是检测细胞总数所在点的组分。 1.8 统计学方法应用SPSS 22.0软件进行相关统计学分析。计量资料以均数标准差（xs）表示，采用t检验。以P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 转染pcDNA3.1-Galectin-9对skov-3细胞Galectin-9蛋白表达的影响Western blot结果显示，转染pcDNA3.1-Galectin-9组Galectin-9蛋白表达量（0.930.01）明显高于空白对照组（0.480.03）和pcDNA3.1组（0.460.02），差异均有高度统计学意义（t = 10.81，P 0.01；t = 10.22， P 0.05）。见图1。2.2 Galectin-9能抑制?胞的增殖CCK-8结果显示，转染pcDNA3.1-Galectin-9组细胞增殖能力（0.7720.124）明显低于空白对照组（1.1350.347）和pcDNA3.1组（1.0630.248），差异均有高度统计学意义（t = 4.266，P 0.01；t = 4.688， P 0.05）。通过时间曲线（0、12、24、36 h和48 h）发现，Galectin-9对抑制SKOV-3细胞的增殖能力呈现时间依赖性。见图2。2.3 Galectin-9能抑制细胞的迁移能力转染pcDNA3.1-Galectin-9组的愈合率（26.032.11）%明显高于pcDNA3.1组（14.531.14）%和空白对照组（14.420.36）%，差异均有高度统计学意义（t = 17.78，P 0.01；t = 36.04，P 0.05）。2.4 Galectin-9能促进细胞凋亡转染pcDNA3.1-Galectin-9组的凋亡率（57.210.89）%明显高于pcDNA3.1组（14.851.57）%和空白对照组（15.020.93）%，差异均有高度统计学意义（t = 79.51，P 0.01；t = 49.37，P 0.05）。3 讨论目前卵巢癌尚缺乏特异性的临床症状，诊断困难，确诊时大部分已处于肿瘤后期阶段5-6，晚期患者5年生存率不到30%1。Galectin-9最早由Wada等7从动物胚肾组织中分离得到，是由130个高度保守的氨基酸序列组成糖识别结合域8，在结节型硬化型霍奇金肿瘤组织中克隆并首次命名9。有报道发现，Galectin-9抑制胶质瘤细胞的增殖及迁移，为胶质瘤提供了新的治疗方向10；Galectin-9的表达降低与多种恶性肿瘤的进展和淋巴转移具有明显相关性，研究发现，在乳腺癌和恶性黑色素瘤患者中，Galectin-9表达的缺失与肿瘤转移呈负相关11-14；Galectin-9表达的缺失与肿瘤转移呈负相关15，且Galectin-9表达水平较高患者的中位生存时间明显高于Galectin-9低表达的患者；Galectin-9的表达与宫颈鳞状细胞癌病理分级呈正相关16，这可能与组织特异性有关；Galectin-9的表达降低导致结肠癌的发生率升高17；在良性卵巢组织中，Galectin-9呈散在或弥漫性表达，而在卵巢癌组织中呈低表达，且与临床分期、病理分期及淋巴结转移密切相关4，18，但迄今为止，关于Galectin-9在卵巢癌细胞系SKOV-3中作用的研究甚少。研究表明，Galectin-9作为细胞质蛋白，可以靶向分泌到细胞核或细胞质中，与细胞质和细胞核中的蛋白相互作用；在过敏反应中诱导嗜酸粒细胞聚集和活化，调节免疫；此外，Galectin-9可以通过p38和ERK信号通路调节细胞成熟和分化12，在介导细胞凋亡、黏附、细胞间聚集和肿瘤转移方面发挥重要作用。本研究构建了pcDNA3.1-Galectin-9转染细胞组、pcDNA3.1组和空白对照组，Western blot结果显示，转染组中Galectin-9蛋白表达上调，进而通过CCK-8和划痕试验证实，卵巢癌细胞SKOV-3转染pcDNA3.1-Galectin-9后，显著抑制SKOV-3细胞的活力、增殖和迁移能力；通过Annexin-V-FITC/PI双染法检测发现，转pcDNA3.1-Galectin-9的SKOV-3细胞凋亡率明显增高，提示Galectin-9可以促进卵巢癌细胞的凋亡，与Galectin-9在食管癌细胞中的研究结果一致2。综上所述，Galectin-9的过表达能够抑制卵巢癌细胞SKOV-3的增殖和迁移，并能促进其凋亡，为卵巢癌的治疗及靶向药物研发提供理论依据。但Galectin-9如何调控卵巢癌的发生发展及侵袭转移的分子机制尚不明确，需要通过实验进一步探讨。参考文献1 Sankaranarayanan R，Ferlay J. Worldwide burden of gynaecological cancer：the size of the problem J. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2006，20（2）：207-225.2 许鹏，方玉松，朱良明，等.半乳糖凝集素-9在食管鳞状细胞癌中的表达及其与临床病理特征的关系J.中国肿瘤生物治疗杂志，2016，23（6）：824-829. 3 Shimabukuro M，Fukuda D，Sata M. Endothelial dysfunction J. Nihon Rinsho，2012，70 Suppl 5：236-242.4 黄福海，潘丽英，徐楚燕.半乳糖凝集素-9在卵巢癌组织中的表达及其临床意义J.安徽医药，2016，20（6）：1158-1160.5 周冬梅，生秀杰，娄思园，等.BRMS1基因对卵巢癌细胞侵袭转移作用及其机制的探讨J.中华肿瘤防治杂志，2011，18（15）：1161-1165.6 赵安成.肿瘤五项标志联合检测对卵巢癌?、断的应用价值探讨J.中华肿瘤防治杂志，2012，19（15）：1184-1186.7 Wada J，Kanwar YS. Identification and characterization of galectin-9，a novel beta-galactoside-binding mammalian lectin J. J Biol Chem，1997，272（9）：6078-6086.8 Fujihara S，Mori H，Kobara H，et al. Galectin-9 in cancer therapy J. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov，2013，7（2）：130-137.9 Tureci O，Schmitt H，Fadle N，et al. Molecular definition of a novel human galectin which is immunogenic in patients with Hodgkins disease J. J Biol Chem，1997，272（10）：6416-6422.10 姚众，陈为亮，徐洋洋，等.半乳凝素-9抑制胶质瘤细胞增殖及迁移J.山东大学学报：医学版，2015，53（4）：1-5.11 Irie A，Yamauchi A，Kontani K，et al. Galectin-9 as a prognostic factor with antimetastatic potential in breast cancer J. Clin Cancer Res，2005，11（8）：2962-2968.12 Kageshita T，Kashio Y，Yamauchi A，et al. Possible role of galectin-9 in cell aggregation and apoptosis of human melanoma cell lines and its clinical significance J. Int J Cancer，2002，99（6）：809-816.13 Liang M，Ueno M，Oomizu S，et al. Galectin-9 expression links to malignant potential of cervical squamous cell car?cinoma J. J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（8）：899-907.14 董超，徐正丰，邱涵，等.Galectin-9在乳腺癌组织中的表达及其对癌细胞侵袭转移的影响J.山东医药，2016， 56（41）：81-83.15 王洋.Galectin-9在结直肠癌中的表达及对NK细胞局部浸润的影响及机制研究D.济南：山东大学，2016.16 徐国荣，冯秀兰，许作鹏.Tim-3及其配体Gal-9与宫颈鳞状细胞癌病理分级和预后的相关性研究J.中外医疗，2014（28）：63-65.17 Yang Q，Hou C，Huang D，et al. miR-455-5p functions as a potential oncogene by targeting galectin-9 in colon cancer J. Oncol Lett，2017，13（3）：1958-1964.18 潘丽英，黄福海，钟雪花.Galectin-9在卵巢癌中的表达及其意义J.中国当代医药，2016，23（11）：36-38.（：2017-08-30 本文编辑：张瑜杰）