烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用

龙源期刊网 烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用作者：刘敏顾志敏来源：安徽农业科学2014年第16期摘要目的获得高产量的烟草叶片原生质体。方法在前人的基础上，在酶浓度和酶解时 间上，对简易大量制备本氏烟叶原生质体的条件进行了进一步的探索；并以此为基础，通过双 分子荧光互补试验进一步研究了其在蛋白互作研究中的应用。结果在纤维素酶浓度为1.3%， 离析酶浓度为0.4%，果胶酶浓度为0.3%，酶解4 h，酶解温度28 C，并在简易纯化的条件下 制备原生质体，所得到的完整原生质体产量最高，并且细胞碎片和杂质均最少。结论该方法 为瞬时表达于本氏烟叶中的荧光蛋白研究提供了重要的技术参考。关键词烟草（Nicotiana benthamiana）；原生质体制备；双分子荧光互补试验；蛋白互作中图分类号S572文献标识码A文章编号0517-6611（2014）16-05002-05植物原生质体（protoplast）词始自Hanstein，即指通过质壁分离，脱去细胞壁的细胞 1。细胞壁是植物细胞的围墙，用其相对坚固的结构包围着其内部的原生质体，保护和支撑 着植物细胞，其主要成分为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。在原生质体的所有分 离方法中，酶解法效果最佳2。随着植物生物学的发展，原生质体已经越来越广泛应用于植 物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等研究领域1，是生理生化研究、基因表达调控研 究、基因定位研究、细胞器制备、细胞融合和新品种培育等研究的理想材料3o目前，原生质体在植物分子生物学领域应用非常广泛，其中就包括蛋白亚细胞定位和蛋白 间相互作用研究。亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。例如在核 内、胞质内或者细胞膜上存在。GFP是绿色荧光蛋白，将所研究蛋白与GFP融合构建到一个 同框阅读框内，然后转化到植物中，提取原生质体，在扫描共聚集显微镜的激光照射下观察绿 色荧光信号，从而可以精确地定位蛋白质在细胞中的位置。植物原生质体双分子荧光互补试验 （简称BiFC）使得活细胞内的蛋白互作可视化4。这种方法被成功的应用到不同生物中的不 同表达系统。BiFC的基本原理是，增强的黄色荧光蛋白（eYFP）的片段通过分别融合到其末 端的连接蛋白的互作重新形成荧光复合体。蛋白复合体的荧光能清晰观察到荧光的空间定位， 如果连接的2个蛋白不互作，则只会形成背景荧光5-6。烟草作为一种模式植物，其发育生长周期非常快，在短期内就能繁育多代。且易于进行农 杆菌侵染试验，荧光蛋白分子在烟草内瞬时表达后，易于观察。国内外众多研究者提出了许多 制备烟草原生质体的方法，比如机械法、化学法和酶解法等，其中酶解法是目前最有效、最快