分子标记的实验原理及操作流程

一 AFLP 分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机 扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态 性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其 基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基 础的标记技术相比,AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已 经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。其基本原理是:以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子 标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增 （在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的 “接头” ,用与接头互补的但 3-端 有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的 片段才能得到扩增 ，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、 荧光法或银染染色法均可检测之。一、实验材料采用青稞叶片提取总 DNA 。二、实验设备1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统，2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3. 美国MJ公司PCR仪4. 安玛西亚电泳仪等。三、实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊 TOYOBO 公司的相关产品DNA 提取试剂盒;EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；Taq 酶,dNTP, PCR reaction buffer;琼脂糖电泳试剂:琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水 (18.2M cm2. 其他实验需要物品微量移液枪(一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA，通过紫外分光光度计检测或用标 准品跑胶检测。一般来说,100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。2、EcoR1 酶消化 (20ul 体系 /样品EcoR1 1ullOxBuffer 2ul 37 C 65 C 30min 终止反应 sample(总 DNA 5ul ddH 2O 12ul3、Mse1酶消化(20ul体系/样品Msel 2ul (lU/ul1OxBuffer 2ulsample(EcoR1 酶切产物 8OC 3Omin 终止反应 ddH 2O 1ul4、T4 DNA Ligase(2Oul 体系 /样品T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul1OxBuffer 2ulsample (双酶切产物lOulMse1 Adaptor 1ul 2265C 1Omin 终止反应 EcoR1 Adaptor 1ulddH 2O 4ul5、预扩增 (2Oul 体系 /样品sample 4ulPrimer(Mse1/EcoR1 1ulAFLP Core Mix 15ul* AFLP Core Mix 配方 :ddH 2O 13.8ulMgCl 2 1.6uldNTPs(2.5mM 1.6ulTaq 酶 (1U/ul 1ullOxBuffer 2ul预扩增程序:94 C 2min94 C56 C72 C 2min6OC 3Omin6、选择性扩增 (2Oul 体系 /样品sample 4ul(预扩增产物稀释 20 倍 Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX lulAFLP Core Mix 15ul选择性扩增程序:94 C 2min94 C 20s66C 30s每循环降1C,共10个循环72C 2min94C 20s56C 30s 20个循环72C 2min60C 30min7、产物电泳检测上样液:Loading Buffer 20ulSample 3ul(稀释 10 倍四、实验结果与分析本实验使用贝克曼库尔特 (BeckmanCoulter 公司 CEQ8000 遗传分析系统, 运用 先 进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验 , 扩增产物在高分辨率毛细管中电泳 分离,采用激光激发荧光采集数据,灵敏度极高,电泳结果通过软件自动统计分 析并转 换成“ 0、 1”矩阵,便于对结果进一步深入分析研究,整个电泳、数据采集和 数据分析 过程由软件来控制完成,最大程度避免了人工操作造成的误差,提高了数据 的可靠性。产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行（图1 ,得到的数据 （图 2用第三方软件再进一步统计分析向辰Fliawri RkIXTOCD：D1440H HI吁莎di個件棺Giirt | IrfTl匚山tri | .JOB| AruaiLag| RmUp| AmibFunm! | Qjii4Jb?. | HRLnuTP| SIFLhuTve| amC jtiifcji| Oil I WrrMwiHir Anriix* Tonuinc 11睥皿*閒图1 AFLP分子指纹图谱MilTill. i图2 AFLP“ 0、1”矩阵图AFLP操作流程图:酶切Mse1 酶切优化 数据分析附录 1:常用的 8对 AFLP 选择性扩增引物:E-AGG: 5-GACTGCGTACCAATTCAGG -3E-ACG: 5-GACTGCGTACCAATTCACG -3E-AAC: 5-GACTGCGTACCAATTCAAC -3E-ACA: 5-GACTGCGTACCAATTCACA -3E-AGC: 5-GACTGCGTACCAATTCAGC -3E-ACT: 5-GACTGCGTACCAATTCACT -3Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头 路 58 号盛和大厦 2-1706E-ACC: 5-GACTGCGTACCAATTCACC -3M-CAA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAA -3 M-CAC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAC -3 M-CAG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAG -3 M-CTA: 5- GAT GAG TCC TGA GTA A CTA -3 M-CAT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAT -3 M-CTC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTC -3 M-CTG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTG -3 M-CTT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTT -3附录2:AFLP传统垂直板电泳（银染法检测介绍:原理与方法同前,区别:1. 选择性扩增引物不带荧光标记; 2.电泳方法不同,采用 测序胶垂直板电泳; 3. 电泳结果采用银染法,比较直观,但条带的统计与分析全人工 化,工作量 大,银染法灵敏度比荧光标记法要低。示例:下图为玉米（maizeDNA的AFLP图谱。Panel A: AFLP fingerprints of control maize DNA using EcoR1 primer E-AGG with eight Mse1 primers: M-CAA (1, M-CAC (2, M-CAG (3, M-CAT (4, M-CTA (5, M-CTC (6, M-CTG (7, and M-CTT (8.Panel B: AFLP fingerprints of control maize DNA using Mse1 primer M-CAG with eight EcoR1 primers: E-AAC (a, E-AAG (b, E-ACA (c, E-ACT (d, E-ACC (e, E-ACG (f, E-AGC (g, and E-AGG (h.Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005网站:地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站:地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706二 ISSR 分子标记的实验原理及操作流程ISSR(inter-simple sequence repeat标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列 并在3或5锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物 来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是,ISSR标记根据生物广泛存在SSR的 特点,利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于 扩增的引物一般为 16-18个碱基序列， 由 1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复 的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5或3末端结合，导致 位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。一、实验材料不同来源的 DNA(30-50ng/ul。二、实验设备PCR 仪， PCR 管或硅化的 0.5ml eppendorf 管，电泳装置，凝胶成像仪。三、试剂1、ISSR 引物:购买成品或根据加拿大 British Columbia 大学设计的 ISSR 引物 序列(见附录自己合成。2、Taq酶3、10xPCR 缓冲液4、MgCl 2:25mmol/L。 5、 dNTP :2.5mmol/L。四、操作步骤:1. 在 25ul 反应体系中,加入模板 DNA 1ul (30-50ng ISSR 引物 1ul (约 5pmolMgCl 2 2uldNTP 2ulTaq酶1单位（U加 ddH2O 至 25ul混匀稍离心 , 加一滴（约 20 ul 矿物油。2. 在PCR仪中预变性94C 2分钟,然后循环:94C 1分钟,45C -68C 40秒, 72 C 1-2分钟，共40轮循环。3. 循环结束后,72C 10分钟,4C保存。4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液（6x于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100 V（电压低带型整齐，分辨率高。5. 电泳结束,溴化乙锭染色 20分钟。6. 用凝胶成像仪观察、拍照操作流程简图:蘇胶电泳Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头 路 58 号盛和大厦 2-1706注:样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品,标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录 UBC Primer Set #9 (Microsatellite 引物名称序列引物名称 序列801 ATA TAT ATA TAT ATA TT851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG 802 ATATAT ATA TAT ATA TG852 TCT CTC TCT CTC TCT CRA 803 ATA TAT ATA TAT ATA TC853 TCT CTC TCT CTC TCT CRT 804 TAT ATA TAT ATA TAT AA854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG 805 TAT ATA TAT ATA TAT AC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 806 TAT ATA TAT ATA TAT AG856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 808AGA GAG AGA GAG AGA GC858 TGT GTG TGT GTG TGT GRT 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG859 TGT GTG TGT GTG TGT GRC 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC861ACC ACC ACC ACC ACC ACC 812 GAG AGA GAG AGA GAG AA862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT863Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头 路 58 号盛和大厦 2-1706864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG815 CTC TCT CTC TCT CTC TG865 CCG CCG CCG CCG CCG CCG 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC 817 CAC ACA CAC ACA CAC AA867 GGC GGC GGC GGC GGC GGC 818 CAC ACA CAC ACA CAC AG868 GAA GAA GAA GAA GAA GAA 819 GTG TGT GTG TGT GTG TA869 GTT GTT GTT GTT GTT GTT 820 GTG TGT GTG TGT GTG TC870 TGC TGC TGC TGC TGC TGC 821 GTG TGT GTG TGT GTG TT871 TAT TAT TAT TAT TAT TAT 822 TCT CTC TCT CTC TCT CA872 GAT AGA TAG ATA GAT A 823 TCT CTC TCT CTC TCT CC873 GAC AGA CAG ACA GAC A 824 TCT CTC TCT CTC TCT CG874 CCC TCC CTC CCT CCC T 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT875 CTA GCT AGC TAG CTA G 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC876 GAT AGA TAG ACA GAC A 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG877 TGC ATG CAT GCA TGC A 828 TGT GTG TGT GTG TGT GA878 GGA TGG ATG GAT GGA T 829 TGT GTG TGT GTG TGT GC879 CTT CAC TTC ACT TCA 830 TGT GTG TGT GTG TGT GG880 GGA GAG GAG AGG AGA 831 ATA TAT ATA TAT ATA TYA 881 GGG TGG GGT GGG GTG 832 ATA TAT ATA TAT ATA TYC 882 VBV ATA TAT ATA TAT AT 833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG 883 BVB TAT ATA TAT ATA TA 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 884 HBH AGA GAG AGA GAG AG 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 885 BHB GAG AGA GAG AGA GA 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 837 TAT ATA TAT ATA TAT ART 887 DVD TCT CTC TCT CTC TC 838 TAT ATA TAT ATA TAT ARC 888 BDB CAC ACA CAC ACA CA 839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG 889 DBD ACA CAC ACA CAC AC 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 890 VHV GTG TGT GTG TGT GT 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC891Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头 路 58 号盛和大厦 2-1706842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG892TAG ATC TGA TAT CTG AAT TCCC843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA 893 NNN NNN NNN NNN NNN 844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC 894 TGG TAG CTC TTG ATC ANN NNN845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG895AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC846 CAC ACA CAC ACA CAC ART 896 AGG TCG CGG CCG CNN NNN NATG847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC 897 CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTGG848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 898 GAT CAA GCT TNN NNN NAT GTGG849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA 899 CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCCA850 GTG TGT GTG TGT GTG TYC900Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站:地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706三 RAPD 分子标记的实验原理及操作流程RAPD 技术的全称是随机扩增多态性 DNA(Random Amplified PolymorphicDNA,此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物, 对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反 向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR,单一引物与反向重复序列结合， 使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点 之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经琼脂 糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。一、实验材料不同来源的 DNA(30-50ng/ul。二、实验设备PCR 仪， PCR 管或硅化的 0.5ml eppendorf 管，电泳装置，凝胶成像仪。三、试剂1、RAPD引物:购买成品或根据赛百盛(SBS公司设计的RAPD引物序列(合 成。 2、 Taq 酶3、10xPCR缓冲液4、MgCl 2:25mmol/L。 5、 dNTP :2.5mmol/L。四、操作步骤:1. 在 15ul 反应体系中,加入 模板 DNA 1ul (30-50ng RAPD 引物 1ul (约 5pmoldNTP 1ulTaq酶0.5单位（U加 ddH2O 至 15ul混匀稍离心 , 加一滴（约 20 ul 矿物油。2. 在PCR仪中预变性94C 2分钟，然后循环：94C 1分钟,36C 1分钟,72C 1 分 钟,共 40轮循环。3. 循环结束后,72C 10分钟,4C保存。4. 在15ul PCR产物中加2ul上样缓冲液（6x于1.6%琼脂糖胶上电泳,稳压50- 100V 。5. 电泳结束,溴化乙锭染色 20分钟。6. 用凝胶成像仪观察、拍照。操作流程简图：Tel： +86 532 80998002 Fax： +86 532 80998005 网站：地址：山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706注:样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头 路 58号盛和大厦 2-1706青岛昊航科贸有限公司 四 SSR 标记的实验原理及操作流程 SSR 简单序列重复 标记（Simple sequence repeat,简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类 由几个核苷酸（15 个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列， 长度 较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相 同，造成了 SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然 SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此 可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电 泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。优点：（1）标记数量丰富，具 有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上； （2）是共显性标记，呈孟德尔遗 传； （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 缺点：开发此类标记需要预先得 知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。操作程序：取叶片-磨样-提 取DNA-PCR扩增-电泳检测-染色-读带标记1、DNA提取按照Doyle和 Dickson（1987CTAB 法（Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改进的程序进 行，具体步骤如下：成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管 中，-20C冰箱保存；加入600ul 65C的2xCTAB混匀并置于65C水浴中保温 30-60分钟；取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:1的氯仿异戊醇； 12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中；加异丙 醇， 12000转/分钟离心 10分钟，倒掉上清液； 干后用 100%的洒精清洗，干后 加适量TE 2、PCR扩增模板DNA的浓度大约25ng/ul,扩增反应体系为20ul。具 体如下：Sterile ddH 2 O PCR Buffer 11ul 3ul 网站：Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005地址：山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706青岛昊航科贸有限公司 dNTP-mix Primer1 Primer2 Taq polymerase DNA 1ul 1ul 0.5ul（2U/yL 3ul 0.5ul PCR 扩增程序为：（2h30min） 预变性:94C, 5 分钟； 变退延循性： 94C, 40秒； 火： 55C 40秒； 伸： 72C, 1分钟； 环：从2到4共38个循环；72C下最后延伸5分钟；4C 5min,扩增产物置于 4C的冰箱保存。3、扩增产物的电泳分离制胶灌胶上样电泳扩增产物用 8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，步骤如下：准备电极液（1XTBE）；将 梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面；不预电泳；点样，电泳220v；拆 板，并及时将内板、边条及梳子洗净。4、凝胶染色固定:10%醋酸，5分钟； 染色:10分钟；漂洗：dH 2 O, 5-10秒；Na 2 S 2 O 3 1min显色： 甲醛-NaOH,直到满意为止；漂洗:dH2O, 2分钟。5、自封带封胶，读带标 记，数码照相摄像，室温风干。 Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 地 址：山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706网站：