常见色谱柱问题解析

1、网上对柱子是否可以反冲一直有争论，那什么样的柱子可以反冲，什么不可 以。反冲后是正者用，还是反着用。具体到各型号柱子不仅是ODS柱，其他如正 向柱、氨基柱、离子交换柱等最好都有解释。答:一般的正相反相柱应该都能反冲，只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲， 不过目前这样的柱子已经比较少见了。反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉，反冲 后还是正着用比较好，以免柱子的两头都被污染。我们一直提倡的是正向使用， 反向冲洗。2、色谱柱的技术都有哪些？比如封尾等，这些技术在应用时都体现在哪里？ 答：色谱柱技术包括填料技术和装柱技术，填料技术自不待言，填料的好坏对色 谱柱分离性能和选择性有决定性影响。装柱技术也没有想象中的这么简单，不同 固定相、不同粒径、不同柱管内径和长度，装柱工艺都有所不同，要装出紧密、 稳定、均一的柱床，更多是一门艺术，需要经验积累。国内和国夕卜想比，我认为 色谱柱的差距在于：国内公司以前都不会自己开发填料，一般买国外现成填料装 柱，买到的填料质量控制权不在自己手里。另外因为装柱历史短，经验积累少， 装柱工艺也没有完全达到国外水平。另外，对色谱柱性能很关键的基础材料一裸 硅胶，国产的还不过关，在纯度、粒径和孔径的均一性方面和国外产品相比，差 距很大。3、柱子在什么情况下可以清洗一下筛板呢？原来也讨论过这个问题，我也拆下 来清洗过，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的 筛板安装上去。问题解决了，但使用寿命会不会减少呢？答：柱头污染了，就取出污染的，再装一些填料。因为加入你刮了些填料，那么 微观的塔板数就少了。假入你刮得不多，仅表面，可能就是一些脏物，所以，问 题解决。但是今后还会有同样问题，再挂，那么不小心刮，影响柱效。建议还是 装一个预柱。4、色谱柱的填装一般有3种情况：1.国外生产填料并填装完成成品卖到国内； 2.国夕卜生产填料，国内填装销售；3.国内生产填料，国内填装销售。5、预柱或保护柱用还是不用的问题！我就想问：安装保护柱后会影响样品分析 吗？我们做的大多是头孢类的抗生素。答应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞， 肯定有害于分离度和柱效，因为保护柱中间有着死体积的存在但是如果保护柱接 得好，并且尽量控制其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。头孢 类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽，有些原料药，可以根据色谱柱的损 耗选择添加预柱（中间是个筛板），制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相 盐分比较大，那还是最好配个保护柱。6、用的是四元梯度泵A50%甲醇和B50%水，经常出现停或进气泡这是什么原因？答：水/甲醇比例在55 :45时，黏度和柱压有个极大值。50 : 50接近了这个极值，柱压是比较高的，但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径，你这 个实例中不知用的什么规格的色谱柱？系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头 供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停机也应该是因为气泡进入压力下降的原 因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。7、填料方法的前三种都是湿法吗，能不能对四种填充方法做一个简短的说明？资料显示:在正常条件下填料粒度20m时干法填充制备柱较为合适；颗粒v20m时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种高压匀浆法，多用 于分析柱和小规模制备柱的填充；径向加压法，Waters专利；轴向加压法， 主要用于装填大直径柱；干法。柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填 充好的商品柱。8、在做多肽药物时遇到下列问题：基线不稳定波动大，流动相A： 1%TFA水 溶液，B:1%TFA乙腊溶液，流动相中不加TFA见不到主峰，基线良好TFA有什 么作用？药典上介绍测定分子量大于2000的样品，选择柱子填料的孔径为 30nm，30nm与10nm对结果有什么区别？答：流动相加入TFA ,应该是起“离子对”的作用吧，在反相色谱分离多 肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸（TFA）作为离子对试剂是常见的手段，流 动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来 改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容 易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰 低于200nm，对多肽在低波长处的检测干扰很小。做多肽样品的时候，300A 孔径的填料相对100A孔径肯定要选择性好点，也就是分离度相对比较好点。9、反相离子对色谱法中，离子对是如何起作用的？答：首先离子对试剂的解离端和目标离子形成离子缔合物，降低其极性，这 样就能较好的在柱子上保留。再者，根据疏水效应理论，离子对试剂的疏水端是 很容易和C18链相互作用的，这样更容易在柱子上保留，所以我认为离子对试 剂作用是混合保留机制，即纯粹的反相保留和离子对保留机制共同作用。10、苯基柱，氤基柱该什么时候考虑用？答：苯基柱用于含苯环的芳香族化合物的测定时，具有较高的选择性。CN 柱可作为一个保留能力最弱的反相柱使用，也可作为一个活性降低的正相柱使用 （保留时间比硅胶柱和氨基柱低很多）。11、还有所谓的死体积怎么测定呢？答:所谓死体积就是完全不保留的物质出峰时从进样到流过色谱柱的总体积， 一般用极性非常强的尿嘧啶的出峰来测定。死体积包括柱体积（色谱柱内溶剂能 占据的空腔体积）和柱外体积两部分。12、四烷基季铵盐(如四丁基硫酸氢铵、四丁基漠化铵、四丁基氢氧化铵等)在 水中电离后，也形成了类似N+H(CH2CH3)3的结构N+(CH2CH2CH2CH3)4,这种 结构也能有效的与Si O产生较强的静电作用，此类离子对用的比较少，但它 的作用仅是掩藏Si O一吗，它对物质的保留性能有何影响，实验中发现检测胺 化物时，流动相中加入磷酸缓冲盐有增加物质保留的趋势，而加入三乙胺则会降 低物质的保留能力？答:前面提到的四丁基氢氧化铵等离子对试剂确实不如辛磺酸钠等极性基是 阴离子的离子对试剂用得普遍源因是酸类极性物质很容易通过降低pH值的方 法提高在反相色谱中的保留能力，降低pH可抑制酸的电离，使酸处于中性状态 而与疏水碳链的作用力增强。而碱类分析物则受硅胶基质pH上限的严重影响(以前上限是8后来抬到10，直到最近杂化硅胶才将pH上限提到12左右)。铵盐类离子对试剂确实有辛磺酸钠等所不具有的屏蔽硅醇基作用，但其主要作用 还是疏水端和疏水固定相结合，外露的阳离子亲水端和酸阴离子作用，从而提高 其保留能力。当然还有第二种解释机理，离子对试剂先和分析物结合，掩藏极性 基，从而提高极性分析物在反相色谱中的保留能力。而且丁基比辛基疏水性差， 这种情况下，认为后面的结合机理占上风的可能性更大。检测胺类化合物，加入 三乙胺预先和硅醇基结合，胺和硅醇基作用被三乙胺取代，保留下降是肯定的。13、滤膜的材质分这么几种：再生纤维素、聚四氟乙烯、硝酸纤维和醋酸纤维等， 之前只知道有有机系和水系之分，各种不同材质的滤膜适合于什么样的样品？ 聚四氟乙烯：适用于所有有机溶剂，酸和盐；醋酸纤维：不适用有机溶剂，特别适用水基溶液。再生纤维素膜：具有蛋白质吸收低，适用于水溶性样品和有机溶剂；尼龙66 :适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%的乙醇，二氯 甲烷，不适用与二甲基甲酰胺;14、普通的C18柱能作为正相色谱柱使用吗？正相色谱体系中最常用也最普通的 是那种色谱柱。正相柱在使用过程中与反向柱相比有什么需要注意的地方？答：普通C18柱作为正相柱使用，我还没听说过。正相色谱分离模式是指 固定相的极性比流动相的极性大，反过来，流动相极性大就是反相。C18固定相 属于疏水性相对比较强的，疏水性强就是极性很弱，应该找不出极性比它更弱的 流动相了。正相体系常见的柱子有：硅胶柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基 柱，最普通的应该就是硅胶柱。正相柱和反相柱比，最需要注意的是水分，正相 柱对水分非常敏感，流动相中水分含量的些微变化对保留时间影响很大，因此正 相柱测定前平衡时间需要几个小时甚至更长。15、我们在用的氨基柱时，有时候峰型突然变宽，有拖尾，用一段时间就又好了， 不明白是什么原因造成的，如果要再生氨基柱的时候应该怎么做呢？氨基柱可以 直接用纯水冲洗吗？如果可以冲的话，一般冲多久？答：氨基柱的硅胶孔内的氨基浓度非常高（大约有1mol/L），在有水存在 的时候，在孔内形成一个pH10左右甚至超过10的很强的碱性小环境，并会导 致硅胶基体慢慢溶解。不过硅胶基体的溶解会生成酸性的硅醇基，又会降低孔内 的pH值，延缓硅胶基体的溶解进程。一段时间后，两个相反的过程会达成一个 动态平衡，从而稳定下来。对你问题提到的这个现象，我想到的是这个原因。氨基柱，要看氨基柱的应用模式，是正相还是HILIC ？这两种模式的情况是 大不相同的。正相使用，一般很怕有水。但HILIC模式应用，一般流动相是乙腈 /水，是不怕水的。不过键合氨丙基基团非常容易水解，所以一般氨基柱不适宜 保存有水的溶剂中。作为正相应用时，流动相中要求一点都不能含水，但清洗柱 子上的污染物质，是可以含水的，因为水有强极性，在正相色谱上洗脱能力极强， 当然不必用100%纯水。氨基柱具体冲洗方法，正相条件按照正相硅胶柱的清洗 方法，HILIC模式按C18柱的清洗方法。16、“磷酸盐缓冲盐渗透力强，有加快硅胶溶解的副作用，它的存在会降低pH 使用范围。”，既然这样，经常使用，柱子寿命是否也下降的快呀？答：经常用磷酸盐，在其它条件差不多一样的情况下，柱子寿命肯定比不用磷酸 缓冲盐相对短一些。但磷酸盐也有不可取代的优点，否则不可能大部分人还在用。17、通常我们在分析天然药物成分的时候结构复杂，无法考察组分的PKa值，哪 我们如何去选择最合适的流动相或者是拖尾该怎么改善呢？答：如果天然产物中没有易电离的极性基团，就不需要用缓冲盐调节pH。 如果天然产物中既有酸性基团，也有碱性基团，譬如有 pKa=6.2的羧基和 pKa=9.0的氨基的两性物质，建议将pH用磷酸盐缓冲盐控制在2.4 （如果是诸 如月旭的Ultimate LP-C18这样的耐酸色谱柱，还可以调得更低）。如果pH控制在6.2-9.0之间，两个基团都处于离子态，保留能力最差，是 最不可取的。如果不清楚复杂物质中含有什么基团也请将pH调到2.4或更低。 因为pH调低，起码抑制了酸性基团的电离而处于中性分子状态，而增加酸性基 团这个部分在反相色谱中的保留能力；另夕卜低pH还抑制了硅醇基的活性，有利 于获取对称的峰形。情况不明时候，为什么不建议调高pH呢？一方面一般色谱柱都不能承受 pH9以上的条件；即使是像月旭的Xtimate系列一样能耐12.5的柱子，调高 pH和调低pH相比，还有一个硅醇基活性大的劣势。18、新出厂液相色谱柱，保护溶剂一般是什么？怎样进行平衡清洗比较好，一般 要平衡多长时间比较好？答：柱子类型不同，保存溶剂也会不一样吧，具体要看说明书的说明。对于 反相柱，一般用甲醇（乙月青）保存，也有用80%左右甲醇浓度的甲醇/水保存的。 般用流动相平衡冲洗10-20个柱体积即可（注意:柱体积不等于空柱管体积， 4.6x250mm的色谱柱空柱管体积是4.15ml，而柱体积只有约2.5ml）。19、峰形后拖尾是什么原因造成的？ 柱物理损坏色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源。唯一的解决方法就是更换新柱。 柱内填料污染流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源。复杂样品可选用0.45um溶剂微 孔过滤（器）或样品预处理柱对样品进行预处理，确保样品中不含微粒杂质。若 样品不便处理，要使用保护柱。柱内填料污染时，可将柱头螺丝卸下，用专用工 具挖出柱内前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修复。或以能溶解污染 物的流动相按色谱柱使用的相反方向，冲洗色谱柱（约20至30倍柱体积，或 视具体情况而定；另外，此时不能接检测器），将污染物冲出色谱柱，再按色谱 柱标明的使用方向使用。 柱进口处有异物当断定是柱进口处有异物时，可将柱头螺丝卸下，取出滤帽并将其置于20%硝肖 酸溶液中，用超声波清洗约20分钟，再置于超纯水中，并用超声波清洗约10分 钟，重新装入色谱柱内即可。 样品浓度过高致使柱超载样品在柱上超载能引起峰展宽，拖尾（或伸舌）。适当减小进样量或样品浓度直 至峰形和保留时间不再改变，便可消除这种不良影响。减小进样量还能改善其分 离度。正常情况下，样品中每种化合物在150x4.6mm柱中进样量保持在3 50ug范围内，不会引起明显超载。 样品溶剂不对 选择合适的样品溶剂，以排除不必要的干扰。最好选用流动相溶解样品。 柱外效应 柱外效应（即进样阀、色谱柱及检测器间的管路过长、直径过粗、管路接头不匹 配、有死体积）是影响色谱柱柱效的主要因素之一。所以在可能的条件下，色谱 柱的两端连接管路要尽可能短，连接管内径尽可能细小，切口务必平整光滑，尽 可能的减小死体积，以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生。 缓冲不足或不合适在缓冲不好或离子强度过低的分离中，也会出现保留时间重现性差和峰形拖尾。增加缓冲浓度（与样品大小相匹配）能改善此情况。 硅醇基团作用 仔细分析色谱柱内填料表面性质可知：反相色谱柱填料的表面大约被键合相覆盖 了一半，其余的就是未被键合的硅醇基团。所谓的保留是指样品分子与键合相相 互作用的皿但是，酸性或碱性化合物与硅胶表面残存的硅醇基团或金属杂质 之间相互作用而引起双重保留机理罔此发生了峰形拖鼠为了减小峰形拖尾， 通常可在流3相加A25mM三乙胺（抑制剂）。三乙胺能与硅醇基团发生强烈 的相互作用，从而降低或阻断样品分子与硅醇基团的作用，以保证保留机理正常 进行，并大大缓解了峰形拖尾 柱内金属污染柱内金属污染（Fe，Ni等）可引起某引些化合物峰形拖尾。金属可由填料本身 带进，也可由腐蚀性流动相缓慢溶解柱进口的金属滤片，随流动相沉积到柱填料 中。例如C18柱填料被金属污染后，造成酸性/碱性样品拖尾，可用碱洗/酸洗后 再键合的填料，得到的峰是尖锐且对称的。20、柱子的柱效影响大吗？ 一般柱子的柱效规定是多少的呀！理论塔板数一般要 达到多少呢？主要有那些因素影响它。答：柱效是柱子性能好坏的一个重要体现指标。柱效会影响分离度，当然是 峰形越尖锐，柱效越高，和其它峰越容易分开。另外柱效高峰形尖锐，对峰面积 的积分误差就小，甚至可以用峰高来定量。一般C18柱，在测定甲苯等不易拖尾的小分子中性不电离物质时，5um的 填料，每米的柱效能达到80000以上的塔板数，就算合格吧。一般药典有规定 最低柱效是2000-3000。但柱子在使用后，由于固定相流失等原因，柱效会逐 步下降，当下降到不符合药典最低柱效要求，或者导致分离度不够时，色谱柱就 算寿命到了。单从柱效逐步下降这个角度看，柱效高的色谱柱相对使用寿命更长。影响柱效的因素有粒径、粒径和孔径分布、固定相键合密度、柱外体积和温 度等，柱子装填紧密、柱床均匀一致也对提高柱效有好处。这些影响因素中，很 多是和生产厂商有关，你这边能做的是尽量减少柱外连接体积。21、流动相中加入四氢呋喃对柱子有损害吗?我现在分析一样品流动相中用到20% 的四氢呋喃才能把峰分到基线.但柱子只能用一个星期分离效果就不好了 .请问 是四氢呋喃损坏了柱子吗？答：四氢呋喃（THF）是反相色谱中洗脱能力极强的溶剂，比甲醇和乙腈都强很 多。在流动相中加入THF能改善某些难分离的物质对的分离度。但THF不稳定， 容易降解生成具有很强反应活性的过氧化物，能与分析物反应生成新化合物，导 致拖尾、峰分裂和鬼峰产生。高反应活性的过氧化物还可以和填料固定相发生化 学作用，THF对柱子有损伤这点是无疑的，而且这种损伤是随时间累积的THF 保质期一般规定是6个月，放得越久，里面产生的过氧化物含量越大，你应该避 免使用生产日期已很久的THF溶剂，而且最好将THF冷藏、干燥和避光保存， 使用前最好能检测一下过氧化物的含量。22、C18分析时染了，我用高流速，和反向冲洗都解决不了，有没有其他的办法？答：高流速反向冲洗是对的，关键你用了什么溶剂冲洗呢？用原来的流动相冲洗 肯定不管用，要不然就不会累积在柱子上了。你应该用流动相中的强溶剂B冲 洗，如果不行，就需要启用再生的程序，当然再生时用的溶剂更强。100%甲醇-100%乙晴-75%乙晴/25%异丙醇-100%异丙醇-100%二氯甲烷-100%正己烷 用每种溶剂冲洗至少10个柱体积，对于250mmx4.6mm的分析柱，合适的冲 洗流速是12ml/min。最后用10柱体积的异丙醇过渡，然后回到原来的流动 相体系。再生还不解决问题，最后一招就是挖补柱头填料，把柱头污染的填料挖 掉，用干净填料填补进去。挖补填料，破坏原有柱床结构，挖补后柱效也不可能 有新柱水平，或许能再维持一段时间，但不会长久。23、反相柱都可以用下面通用的方法清洗维护： 流动相中不含缓冲盐：甲醇（或乙月青）：水=90 :10反向冲洗色谱柱45min 流动相中含缓冲盐：甲醇（或乙月青）：水=10:90反向冲洗45min ;然 后甲醇（或乙青）：水=90 ：10反向冲洗色谱柱45min。（注意：甲醇（或 乙腈）：水=10 ： 90容易长菌，使用时间不可超过3天） 水性柱保存体系也不特别：短期保存在所用的流动相中（不含缓冲盐），中长期保存在纯甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中。24、柱塞板可不可拆下用超声波清洗，会有什么不良后果？答:不建议将柱筛板拆下清洗，因为拆下承压的柱筛板会导致柱床发生变化， 影响色谱性能。应该对污染的色谱柱先进行清洗维护，维护没有效果，再把拆洗 柱筛板作为最后的手段。25、XDB柱和SB柱是有区别的，XDB键合度高，封尾良好，反相保留能力强； 而SB柱，未进行封尾，对极性物质选择性好。26、保护柱和预柱的作用是不是一样的，如果不一样有什么区别么？保留时间漂 移多少为可以接受的范围？答：保护柱一般带填料，相当于一根缩短了的色谱柱（一般是1-2cm长度）， 卡套里可更换的柱芯，柱管、筛板和填料都有。保护柱里的柱芯好像是在前面开 路的扫雷部队，流动相和样品里如有什么损害柱子的污染物，保护柱就自己承受 了下来。预柱，一般指的就是接在进样器和色谱柱之前的在线过滤器。在线过滤 器和保护柱的最大区别是不带填料，只有可更换的筛板。预柱只能保护色谱柱免 受颗粒物质的污染，而不能阻挡溶解在流动相中的强保留物质。保留时间是液相色谱中一个很有用的诊断分离问题的工具。保留时间受流动 相组成、温度、pH、流速、固定相流失和柱老化等很多因素的影响，如果所有这 些参数保持不变，保留时间也保持恒定。但在实际操作中，不可能对每个色谱参 数进行很完美的控制，如即便加了柱温箱，温度还是会有波动；流动相组成会因 组分挥发性不同而改变。所以保留时间有上下0.02-0.05min的变动是非常正常 的，对某些方法有0.1min上下变动也属正常。保留时间有大的变化，预示着系 统和方法存在问题。流路里有气泡存在，泵阀有泄漏，会因流量降低而导致保留 时间增加。梯度混合比例阀故障也是保留时间变化原因之一。