分子生物实验课件：分子克隆实验（实验一、二、三）

分子生物学检验技术分子生物学检验技术School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University1分子克隆分子克隆分子生物学检验技术分子生物学检验技术2分子克隆分子克隆 分：分离目的：分离目的DNA片段。（实验一）片段。（实验一）切：限制酶切割目的基因与载体。（实验二）：限制酶切割目的基因与载体。（实验二）接：拼接重组体。（实验二）：拼接重组体。（实验二）转：转入受体菌。（实验三）：转入受体菌。（实验三）筛：筛选重组体。（实验三）：筛选重组体。（实验三）School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术实验一实验一3碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA的分离和电泳鉴定的分离和电泳鉴定School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术4School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University 掌握碱裂解法提取质粒掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。的原理和方法。了解实验中所使用试剂的作用。了解实验中所使用试剂的作用。实验目的分子生物学检验技术分子生物学检验技术5School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University实验基本原理染色体染色体DNA质粒质粒DNA 碱裂解法是利用碱裂解法是利用质粒质粒DNA与染色与染色体体DNA在变性与在变性与复性中的差异来复性中的差异来达到分离的目的达到分离的目的。分子生物学检验技术分子生物学检验技术6School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University实验基本原理 当菌体在当菌体在NaOH-SDS溶液中裂解时，蛋白质与溶液中裂解时，蛋白质与DNA会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后，会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后，质粒质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；而染色体心时留在上清中；而染色体DNA、大分子、大分子RNA以及蛋白质以及蛋白质-SDS复合物等形成沉淀，可通过离复合物等形成沉淀，可通过离心去除。心去除。分子生物学检验技术分子生物学检验技术7School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University试剂中的主要成分和作用 GTE缓冲液缓冲液葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。底部。Tris-HCl溶液：调节溶液：调节pH。EDTA：二价金属离子螯合剂，抑制：二价金属离子螯合剂，抑制DNase活性。活性。分子生物学检验技术分子生物学检验技术8School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University NaOH-SDS溶液：溶液：NaOH：溶解细胞，破坏核酸碱基配对使氢键断裂：溶解细胞，破坏核酸碱基配对使氢键断裂从而让核酸变性。从而让核酸变性。SDS：裂解细胞，结合蛋白质，形成：裂解细胞，结合蛋白质，形成SDS-蛋白质蛋白质复合物。复合物。分子生物学检验技术分子生物学检验技术9School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University 乙酸钾溶液：乙酸钾溶液：乙酸：中和乙酸：中和NaOH，使质粒，使质粒DNA复性为可溶性复性为可溶性DNA。钾离子：置换了钾离子：置换了SDS的钠离子形成不溶性的的钠离子形成不溶性的PDS，将基因组，将基因组DNA和蛋白质沉淀下来。和蛋白质沉淀下来。分子生物学检验技术分子生物学检验技术10School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University 异丙醇：快速沉淀质粒异丙醇：快速沉淀质粒DNA，但难以挥发。，但难以挥发。70%乙醇：去除异丙醇，且易于挥发除去。乙醇：去除异丙醇，且易于挥发除去。TE缓冲液：溶解质粒缓冲液：溶解质粒DNA沉淀，含有沉淀，含有EDTA能能够使够使DNA保存时间更长。保存时间更长。分子生物学检验技术分子生物学检验技术11School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University具体步骤具体步骤1.取1.5ml对数生长期的菌体于Eppendorf管中，8000rpm离心1min，收集菌体。2.弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。3.加入100m ml GTE缓冲液，轻轻吹打重悬菌体，室温放置5min。4.加入200m ml新鲜配制的NaOH-SDS（100m ml 2mol/L NaOH+100m ml 10%SDS+800m ml双蒸水）溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。动作轻柔，同时控制好时间！分子生物学检验技术分子生物学检验技术12School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University5.加入150m ml预冷的乙酸钾溶液，充分颠倒混匀，冰浴5min。一定要充分混匀！6.4，12000rpm离心5min，取上清300m ml 转移至另一支新的EP管中。7.加180m ml异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清液。8.缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒，12000rpm离心1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！最后沉淀不要过于干燥！分子生物学检验技术分子生物学检验技术13School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University9.用30m ml 含有RNase的TE溶液溶解沉淀的DNA，37 水浴30min，4 保存。l配制1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖粉末+100mlTAE缓冲液+5ml 10mg/ml EB。l上样6ul（5ml 质粒DNA+1ml 6Loading Buffer），120V稳压电泳鉴定质粒DNA。分子生物学检验技术分子生物学检验技术14School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University预期实验结果质粒DNA在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型（超螺旋scDNA）存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度等原因，可能会使DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）；开环DNA（ocDNA）；线性DNA（LDNA）。LDNAocDNAcccDNA电泳方向分子生物学检验技术分子生物学检验技术15School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University注意事项 NaOH-SDS溶液处理时间不能太长，且不能激烈震荡，否则会断裂基因组DNA使之混入质粒DNA中。加入预冷乙酸钾后要充分颠倒混匀，以中和NaOH，沉淀蛋白质和染色体DNA等。70%乙醇洗涤时不要吹打质粒DNA沉淀，否则DNA会溶解在水中。同时DNA沉淀不能太过干燥，否则影响TE溶液溶解。配制琼脂糖凝胶和电泳时，注意防护安全，不要将电泳使用过的手套带出电泳房。分子生物学检验技术分子生物学检验技术16School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical UniversityDNA的限制性酶切胶回收与连接实验二实验二分子生物学检验技术分子生物学检验技术17School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University 掌握限制性内切酶特异性切割掌握限制性内切酶特异性切割DNA的原理与方法的原理与方法 掌握掌握DNA片段从琼脂糖凝胶中回收的原理与方法片段从琼脂糖凝胶中回收的原理与方法 掌握如何构建体外重组掌握如何构建体外重组DNA分子及分子及DNA的连接方的连接方法法实验目的分子生物学检验技术分子生物学检验技术18School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical UniversityDNA的限制性酶切反应的原理 限制性内切酶限制性内切酶（restriction enzyme)是一类识别是一类识别DNA上特异核苷酸序列并产生切割反应的核酸内切酶上特异核苷酸序列并产生切割反应的核酸内切酶(endonuclease)的总称。的总称。限制性内切酶识别的限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为序列一般长度为46个核苷个核苷酸，具有酸，具有回文结构回文结构（双链（双链DNA中含有的中含有的二个结构相同、方向相反二个结构相同、方向相反的序列的序列，或称为反向重复序列，或称为反向重复序列）特征。特征。分子生物学检验技术分子生物学检验技术 酶切反应体系酶切反应体系（20 m ml）质粒质粒DNA(sod-T vector)：10 m ml 10M:2 m ml Hind:1 m ml EcoR:1 m ml ddH2O :6 m ml37水浴水浴1.5 h，加，加2 m ml 10 loading buffer终止酶切反应，取终止酶切反应，取全部的样品用于电泳。全部的样品用于电泳。(所需要用到的酶及缓冲液均需冰浴，以防蛋白变性)School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical UniversityHindEcoR分子生物学检验技术分子生物学检验技术从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段 在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些非目的片段，这些片段可能会对连，还会产生一些非目的片段，这些片段可能会对连接反应产生干扰，去除这些非目的片段的最好的方接反应产生干扰，去除这些非目的片段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收。法就是进行琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收。School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术琼脂糖凝胶回收的原理 不同分子量的不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中泳动速度片段在琼脂糖凝胶电泳中泳动速度不一样而分离。不一样而分离。NaI存在条件下，加热至存在条件下，加热至55，含有，含有DNA片段的琼脂片段的琼脂糖凝胶就会融化，然后可利用硅胶树脂吸附糖凝胶就会融化，然后可利用硅胶树脂吸附DNA分子分子，从而得到纯净的，从而得到纯净的DNA片段。片段。School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术琼脂糖凝胶回收的原理School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University 硅胶树脂硅胶树脂在在酸性高盐离子酸性高盐离子浓度下可以高效专一的吸附浓度下可以高效专一的吸附DNA，通过离心可将，通过离心可将DNA片段沉淀下来，在片段沉淀下来，在碱性低盐离子碱性低盐离子浓度浓度下其与下其与DNA的结合能力会急剧降低，的结合能力会急剧降低，如：如：使用弱碱溶液如使用弱碱溶液如TE(pH8.0)就可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的就可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段片段。分子生物学检验技术分子生物学检验技术1.取一干净的取一干净的1.5ml的的EP管，称重，做好标记。管，称重，做好标记。2.紫外下用干净的手术刀切下含有目的片段（紫外下用干净的手术刀切下含有目的片段（600-700bp左右）的凝胶块，放入左右）的凝胶块，放入已称重已称重的的EP管中，再次称重。管中，再次称重。3.按每按每100mg琼脂糖凝胶块：琼脂糖凝胶块：400 m ml Binding Solution的量的量，添加，添加Binding Solution至装有凝胶的离心管中。至装有凝胶的离心管中。50-60放置放置5-10min融胶。融胶。期间可震荡混匀数次，使凝胶期间可震荡混匀数次，使凝胶充分融解。充分融解。步骤：School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术4.将上述混合液转移至将上述混合液转移至Genclean柱中，室温放置柱中，室温放置2 min，6000rpm室温离心室温离心1 min。将离心下来的液体倒回将离心下来的液体倒回Genclean柱中再重复离心一次以提高回收效率。柱中再重复离心一次以提高回收效率。5.弃收集管中的废液。往弃收集管中的废液。往Genclean柱中加入柱中加入500 m ml Wash Solution，12000rpm，1min，弃废液。，弃废液。6.重复步骤重复步骤5一次。一次。步骤：School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术7.将将Genclean柱放回收集管中，柱放回收集管中，12000 rpm 离心离心1 min，彻底彻底去除去除Wash Solution。8.将将Genclean柱放到一干净的柱放到一干净的1.5 ml的的EP管中，加入管中，加入30 m ml Elution Buffer，37 放置放置2 min，12000 rpm离心离心1 min。9.取取5 m ml目的目的DNA，加入，加入1 m ml 6Loading Buffer，电泳鉴定。，电泳鉴定。剩余目的剩余目的DNA将用于后续实验或将用于后续实验或-20 保存。保存。步骤School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术溴化乙锭染色后的溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故易受紫外光破坏，故切胶时间尽量短切胶时间尽量短。切胶时，切胶时，尽量沿目的片段边缘切下尽量沿目的片段边缘切下，使其所带的琼脂糖尽量少，使其所带的琼脂糖尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。将目的将目的DNA吸附在吸附在Genclean柱上，要柱上，要重复回收一次重复回收一次，以提高目，以提高目的的DNA的回收效率。的回收效率。Wash Solution清洗清洗Genclean柱两次后，要柱两次后，要再离心一次再离心一次，以去除，以去除残余的残余的Wash Solution，避免影响后续，避免影响后续TE洗脱目的洗脱目的DNA。注意事项School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术DNA的重组连接的原理 DNA重组连接重组连接是通过将已经切开的载体和外源是通过将已经切开的载体和外源DNA，通，通过过DNA连接酶催化两个双链连接酶催化两个双链DNA片段相邻的片段相邻的5端磷酸与端磷酸与3端羟基之间形成磷酸酯键，从而形成新的端羟基之间形成磷酸酯键，从而形成新的DNA。本实验利用本实验利用T4DNA连接酶，有连接酶，有Mg2+、ATP存在的连接反存在的连接反应体系中，将载体应体系中，将载体puc18与目的基因与目的基因sod连接起来。连接起来。School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术 连接体系（连接体系（10ul）：）：目的基因（目的基因（sod）：）：7ul 载体（载体（puc18）：）：1ul Buffer:1ul T4DNA ligase:0.5ul ddH2O:0.5ul(所需要用到的酶及缓冲液均需冰浴，以防蛋白变性所需要用到的酶及缓冲液均需冰浴，以防蛋白变性)School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术29School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University感受态细胞的制备和转化及重组质粒的筛选实验三实验三分子生物学检验技术分子生物学检验技术1 1、掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理、掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理2 2、掌握蓝白斑筛选重组质粒转化的原理、掌握蓝白斑筛选重组质粒转化的原理实验目的实验目的School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术 冷冷CaCl2CaCl2转化原理转化原理 受体细胞处于0、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀呈球形，细胞膜的通透性发生改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞，外源DNA吸附于细胞表面，经42 短时间热击处理，促使细胞吸附DNA复合物。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术重组子的筛选重组子的筛选（1 1）抗生素筛选法）抗生素筛选法 pBR322质粒携带有质粒携带有氨苄青霉素氨苄青霉素和和四环素抗性四环素抗性基因，基因，可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素和四环素抗可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素和四环素抗性，将经过转化后的受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青性，将经过转化后的受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素和四环素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，霉素和四环素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素而无法存活。而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素而无法存活。School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术（2 2）互补法）互补法 蓝白斑筛选（蓝白斑筛选（IPTG-XgalIPTG-Xgal）试验：）试验：野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术操作步骤操作步骤 School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University1.取菌液1.5ml于EP管中，冰上放置10 min；4，4000 rpm离心10 min，去上清，收集菌体。(从这一步开始，所有操从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳作均在冰上进行，速度尽量快而稳)2.用500 ml预冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10 min。3.4，4000 rpm离心10 min，弃去上清液，加入50ml预冷的0.1mo1L CaCl2溶液，加入10 ml重组质粒DNA溶液，轻轻混匀，小心悬浮细胞后置于冰上30min。分子生物学检验技术分子生物学检验技术4.将上述混合物转移到将上述混合物转移到42水浴锅中，热休克水浴锅中，热休克90s（不不要摇动要摇动EP管！管！），然后将），然后将EP管迅速转移到冰上，管迅速转移到冰上，冷却冷却2-5min。5.向上述管中加入向上述管中加入400 ml 的的LB液体培养液，然后液体培养液，然后37，100 rpm，振荡培养约，振荡培养约45-60 min.School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术6.取取100 ml转化细胞至含有适当抗生素的转化细胞至含有适当抗生素的LB平板上，平板上，用灭菌的玻璃棒（用灭菌的玻璃棒（一定要冷却后再涂菌！）一定要冷却后再涂菌！）涂布均涂布均匀，室温放置待菌液完全被吸收后，倒置培养皿，匀，室温放置待菌液完全被吸收后，倒置培养皿，37培养过夜。培养过夜。School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical University分子生物学检验技术分子生物学检验技术