介绍动物细胞基因重组技术的最新进展

介绍动物细胞基因重组技术的最新进展摘要：本文主要介绍俩种动物细胞基因重组技术的最新进展。一种是探索建立能 有效表达和分泌人类B防御素2(Hbd2),其表达产物又易于被检测和分离纯化的 哺乳类动物细胞表达系统的可能性及技术路线。用脂质体转染法将此重组真核表 达载体导入cos-7细胞,分别从m RNA和蛋白质水平分析HBD2的表达情况并同步检 测细胞可溶性蛋白及培养上清的抗菌活性。结果显示：所建立的hbd-2哺乳类动 物细胞表达系统能有效表达和分泌活性hbd-2.另一种是利用双启动子构建人补 体调节蛋白DAF和MCP的双顺反子重组表达载体pcDNA3-DAFMCP-DP,以磷酸钙沉淀 法转染NIH3T3细胞，用G418帅选获得NIH3T3pcDNA3-DAFMCP-DP转化细胞。结果表 明，DAF和MCP双基因重组表达载体实现了人补体调节蛋白基因高效转移和高水平 共表达，为获得表达多种人补体调节蛋白的理想供体提供了有效策略.而且共表 达的DAF和MCP具有协同效应，能更有效地阻止补体激活造成的细胞损伤。在克服 超急性排斥反应的基因治疗中具有潜在的，临床应用价值。关键词：基因重组 共表达 协同作用 补体一、研究进展1.1标题一 b-防御素-2在cos-7细胞的转染表达广泛分布于粘膜上皮组织的人类b-防御素具有高效的抗菌和诱导性表达等特性。 其在机体粘膜防御中很重要。但因其强的抗菌活性，在原核细胞中表达往往会导 致宿主自杀性死亡，所以用动物细胞做宿主。Cos细胞系是进行外源性DNA真核表 达最常用的宿主细胞之一。对SV4 0系列载体具较高敏感性。用全长HBD-2cDNA片 段插入到带报告基因Flag的真核表达质粒pCmV的多克隆位点中，构建出Hbd-2的 重组真核表达载体。通过PCR和western blot法证实hbd-2基因能在被转染的 cos-7细胞内持续有效的表达。通过检测标签基因flag的表达，可在蛋白质水平 间接的反应hbd-2的表达情况，取消了构建目的基因表达产物的特异性抗体的必 要性。但该系统的不足之处在于：1所含有的标签基因flag位于重组嵌合肽的上 游-因而不能排除hbd-2的前导肽在细胞内被修饰加工转化为成熟肽并被分泌至 胞外的过程中，位于hbd-2N端上游的flag标志丢失的可能；2对所表达的重组产 物没有相应的分离纯化措施。因此，本研究在前期实验的基础上，选择编码双重 标签基因myc和6his的真核表达质粒。将全长的hbd-2cDNA插入紧邻标签基因myc 和6his的上游，构建另一种重组真核表达载体转染cos-7细胞。因为插入的目的 基因紧邻于标签基因的上游，且与其共享同一启动子pcmv，所以有可能避免标签基因在细胞内修饰加工乃至分泌而丢失，从而获得c端带稳定mcy 和6his双重标志，具有抗菌活性的hbd-2基因表达产物。2标题二人补体调节蛋白DAF、MCP在哺乳动物细胞中的共表达及协同作用研究 补体激活是一个多途径的过程，C3的活化是3条激活途径的中心环节，因此有 效阻止C3的活化成为克服超急性排斥反应，实现异种器官移植临床应用的关键。 MCP作为一种补体调控蛋白，具有细胞表面标记和辅助活性，能通过与C4B或C3B 结合促进其裂解酶I因子对其进行裂解灭活，从而中断补体激活途径，保护宿主 免受同源补体的攻击。衰变加速因子DAF则通过与自身细胞膜的C3转化酶及C5 转化酶特异性结合，从而加速经典和替代途径C3/C5转化酶的衰变；同时DAF 依赖于它与C4b和C3b的高亲和力与C2a和Bb亚基竞争性结合在C4b和C3b的 同一部位，最终阻止补体两条激活途径C3及C5转化酶的装配，从而阻断补体级 联反应。此外，DAF还可解除B、D因子对MCP活性的抑制作用，完成由MCP辅 助的I因子介导的结合型C3b的降解作用。二者都通过不同的方式来抑制C3转 化酶的形成或使已形成的C3转化酶加速分解，功能互补，结合可以更有效地抑 制C3 / C5转化酶的活性，因此联合应用DAF和MCP在超急性排斥反应的控制、 异种器官移植研究领域具有重要意义。二总结分析和建义2.1标题一 b-防御素-2在cos-7细胞的转染表达看了这篇文章发现所用的技术手段都是生物课和实验课上学的，所以可以看的 懂。每个实验都有设想，实验，检验等几个步骤。本实验用双酶切bamhl和xhol 俩个位点连接hbd-2基因到质粒上。用质粒的氨苄青霉素抗性基因刷选重组质 粒。用RT-PCR法检测hbd-2mDNA的表达，用western印迹检测hbd-2蛋白的表 达。实验结果显示co-7细胞表达和分泌的产物有抗菌活性。此质粒能够在大多 数哺乳动物内高水品稳定表达，且其表达产物易于检测和纯化。2.2标题二人补体调节蛋白DAF、MCP在哺乳动物细胞中的共表达及协同作用研 究这个实验也是双酶切连接DAF和MCP基因到质粒上，用PCR扩增，用质粒的氨苄青 霉素抗性基因刷选重组质粒。然后转染细胞培养。然后检测表达产物。结果说明 转化细胞所表达的补体调节蛋白DAF和MCP具有同源限制作用，能够保护转化细胞 使之免受人补体的溶破作用，而且DAF和MCP双基因的共同作用能提供更全面的协 同保护作用，能更有效地阻止补体激活造成的细胞损伤。参考文献1， 杜军，黄宁。b-防御素-2在cos-7细胞的转染表达。生物医学工程 学杂志。2003，,20 (2)： 255-259；2， 徐丽，刘辉。人补体调节蛋白DAF、MCP在哺乳动物细胞中的共表达 及协同作用研究。生物工程学报。2008,24 (2)： 220-225o