TB细胞协作研究的重大突破——滤泡辅助性T细胞的发现

TB细胞协作研究的重大突破滤泡辅助性T细胞的发现 Tfh; IL21; ICOS; CXCR5; Bcl6 毕业二十世纪60年代, Claman和Miller等1, 2分别采用照射或胸腺切除的小鼠模型, 同时过继转移正常小鼠骨髓细胞和胸腺细胞, 或过继转移胸腺细胞或胸导管淋巴细胞, 才能产生针对羊红细胞抗体, 发现了B细胞对某些抗原（后称为T细胞依赖抗原）刺激产生抗体必须要有T细胞的辅助。抗体分泌细胞产生于外周淋巴器官（脾脏、 淋巴结、 扁桃腺和派氏集合淋巴结等）生发中心（germinal centers,GC）, 并在那里发生体细胞高频突变、 抗体类别转换和高亲和力的选择。GC也是CD4+辅助性T细胞（Th）直接辅助B细胞的部位, Th对于GC的形成, 选择高亲和力B细胞分化为记忆细胞或浆细胞, 以及维持长时间的体液免疫应答等方面都发挥着关键作用。虽然Th细胞辅助B细胞产生抗体的研究已有40年历史, 但“辅助性T细胞”的真正面貌并不清楚, 一度曾认为认为Th2是T细胞辅助B细胞的主角(图1)。2000年Schaerli和Breitfeld几乎同时报道了一个定位于淋巴滤泡、 具有辅助B细胞功能、 表型为CXCR5+ CD40L+ ICOS+的T细胞亚群, 称为滤泡B辅助性T细胞3,4。2002年Moser等5撰写了题为“CXCR5+ T cells:follicular homing takes center stage in Thelpercell response”综述, 并且提出了Tfh可能是不同于Th1和Th2的一个新的T细胞亚群。直到最近才确定, 滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells,Tfh）是主要负责辅助B细胞的T细胞亚群。Tfh上表达的CD40Lhi和ICOShi分别通过与B细胞上CD40和ICOSL结合, 以及Tfh所分泌的IL21, 在刺激B细胞的增殖、 分化以及免疫球蛋白类别的转换中起着十分重要的作用。此外, 表达CXCR5的Tfh在淋巴滤泡处产生CXCL13的趋化下, 被募集到淋巴滤泡并与B细胞共定位和相互作用, 因此, CXCR5成为Tfh迁移、 定位重要的“转运分子”（trafficking molecules）, 也是Tfh细胞重要的表面标志。Bcl6目前认为是可能控制初始T细胞分化为Tfh的转录因子。不难看出, 黏附分子、 细胞因子、 趋化因子和受体、 转录因子以及这些分子基因敲除模型的建立, 为发现和确定Tfh细胞亚群提供了坚实的基础, 从这个意义上来说, 现在确定Tfh为一个新的CD4+效应细胞亚群是“水到渠成”的。 毕业 图1T细胞辅助B细胞40年研究历史（略） 毕业1Tfh的来源以及与Th1、 Th2、 Th17和Treg的关系以往认为, Th2细胞通过分泌IL4刺激B细胞增殖和Ig类别转换, 上调B细胞CD40和MHC类分子的表达, 是辅助B细胞主要的T细胞亚群。实际上, IL4-/-小鼠仍然可产生针对T细胞依赖抗原的抗体11。目前已经明确, Tfh是辅助B细胞主要的T细胞亚群, 而Th1和Th2所分泌的细胞因子在B细胞活化和Ig类别转换中只起到调节的作用。初始T细胞表达CCR7而不表达CXCR5, 通过CCR7与相应配体二级淋巴组织来源的趋化因子（SLC）/CCL21结合, 使初始T细胞进入外周淋巴器官的T细胞区12。活化CD4+T细胞可一过性表达CXCR5, 因此也具有被迁移到淋巴滤泡的能力, 这一过程与CD28、 OX40和ICOS所介导的信号转导有关, 而且CXCR5表达发生在活化T细胞增殖和分化之前。但是完全极化（full polarized）的Th1和Th2又不表达CXCR5（图2）。在T细胞中有一部分持续表达CXCR5, 主要迁移到B细胞滤泡中, 同时表达ICOShi、 CD40Lhi和分泌IL21, 执行辅助B细胞的功能, 成为滤泡辅助性T细胞。 毕业图2CD4+T细胞亚群的分化与转录因子、 趋化因子受体以及分泌细胞因子的关系（略）毕业有趣的是, Tfh与Th17两个亚群有某些相似之处, 如都表达IL21, 分化发育都依赖于IL6、 IL21和STAT3。但Tfh不产生IL17A、 IL17F和IL22, 其分化也不依赖TGF的RORt转录因子9。 毕业2参与Tfh细胞功能的关键分子参与Tfh细胞功能的关键分子见表1。 毕业表1参与Tfh细胞功能的重要分子（略） 毕业注: （1）除Tfh外, IL21还可由Th17和NK T细胞产生;（2）在Tfh表达的共刺激分子中, CD40Lhi对B细胞体液免疫功能也有重要调节作用;（3）Tfh表达高水平的IL6R和IL21R, 后者参与Tfh自分泌IL21的功能; 此外Tfh还分泌IL10;（4）Tfh还表达PD1和BTLA等负性调节的共刺激分子. 毕业 2.1Bcl6与Tbet、 GATA3/Stat6、 FoxP3、RORt分别决定Th1、 Th2、 Treg或Th17谱系分化不同, 决定Tfh细胞的转录因子目前尚不能完全确定。但多种证据提示, Bcl6(Bcell CLL/Lymphoma 6, zinc finger protein 51)可能发生挥着重要作用。虽然GC中B细胞可表达Bcl6, 但在CD4+T细胞中, Bcl6优先表达于Tfh13, 而不表达于Th1和Th2,Bcl6-/-小鼠由于缺乏GC形成, 针对T细胞依赖抗原的抗体应答受损, 抗体亲和力成熟也发生障碍17,18。此外, Bcl6表达还抑制了GATA3表达, 抑制T细胞IL4分泌19。Bcl6还可抑制TGFSmad信号途径, 提示不存在TGF可能有利于Tfh的分化9。值得注意的是, GC中CD4+T细胞仅有10%15%表达Bcl6。 毕业2.2IL21IL21是属于c依赖的细胞因子（cdependent cytokines）。共用c（CD132）作为其受体亚单位的细胞因子有IL2、 IL4、 IL7、 IL9、 IL13、 IL15、 IL21以及胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin,TSLP）。IL21 2000年基因克隆成功。IL21主要由Tfh、 Th17和NK T细胞产生, Th1和Th2也可分泌IL21, 但水平较低13。由于IL21是Tfh细胞执行效应功能的主要细胞因子, 因此又称为Tfh表达的辅助性细胞因子（Tfhexpressed helper cytokine）。IL21缺陷小鼠Tfh细胞发育障碍。IL21R由结合IL21的IL21R 链和c组成, 分布广泛, 但主要表达于B细胞、 Tfh、 Th17和NK细胞, 因此上述细胞也是IL21作用的主要靶细胞。 毕业2.2.1IL21对B细胞的调节作用B细胞是IL21作用的主要靶细胞。当CD40 mAb交联刺激人B细胞时, IL21可使活化B细胞分泌IgG1和IgG3。IL21可诱导所有B细胞亚群（包括新生B细胞、 初始B细胞、 过渡型B细胞、 生发中心B细胞以及记忆B细胞）分化为Ig分泌细胞（Igsecreting cells,ISC）, 分泌大量IgM、 IgG和IgA14,20-22。一般来说, IL4对初始B细胞的作用要明显强于作用于GC和记忆B细胞的作用; 而IL10则优先增强GC 中的B细胞和记忆B细胞分化为ISC。由Tfh产生的IL21, 在B细胞对T细胞依赖抗原的初始免疫应答、 再次免疫应答以及体液免疫长期的维持中都发挥了主要作用14。以往认为, IL10是最为重要的刺激人B细胞分化为浆细胞的细胞因子。相比之下, IL21在CD40 mAb刺激人B细胞分化为浆细胞的效能是IL10作用的100倍14。CD40 mAb联合IL21刺激人B细胞可诱导其表达酶活化诱导的胞嘧啶脱氨酶（enzyme activationinduced cytidine deaminase,AID）和B细胞成熟蛋白1（Blymphocyte maturation protein1,Blimp1）, AID和转录因子Blimp1分别在Ig类别转换和B细胞向浆细胞分化中起着关键作用20。IL4可通过抑制Blimp1的表达抑制IL21对初始B细胞的刺激作用; 而记忆B细胞则对IL4抑制IL21的作用有抵抗14。IL21-/-小鼠B细胞应答水平明显降低。 毕业 2.2.2IL21对Tfh的调节作用Tfh本身也表达IL21R, IL21通过以下几方面调节Tfh: 诱导Tfh分化, IL21或IL21R缺陷小鼠Tfh细胞数量锐减; IL21通过自分泌形式促进Tfh细胞表面CXCR5的表达, 使其向淋巴小结和生发中心迁移, 并在那里与B细胞相互作用, 因此IL21也是GC形成中的关键细胞因子; 诱导Tfh细胞ICOS表达, 发挥Tfh辅助B细胞的功能（见下述）。IL21R信号转导是通过Vav1调控T细胞受体信号体（T cell receptor signalosome）实现的。Vav1是Rho家族GTPases中一种鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor,GEF）, 在NFATc1活化中发挥重要作用, 可下调细胞周期抑制物p27kip1水平, 促进IL2产生、 肌动蛋白多聚化和TCR成簇。IL21诱导Vav1中酪氨酸发生磷酸化, 从而增强了TCR信号强度, 有利于Tfh分化10。 毕业 2.2.3IL21对Th17和NK细胞的调节作用IL21也是Th17产生和分化的重要的自分泌细胞因子。由于Th17表达CCR4和CCR6而不表达CXCR5, 因此Th17被募集到炎症区域, 而不迁移到淋巴小结。IL21可促进NK细胞的分化, 诱导其产生IFN。 毕业2.3ICOS诱导性协同刺激分子（inducible costimulator,ICOS）是CD28家族中的一个成员, 为T细胞活化所诱导。ICOS基因1999年克隆成功23, 2004年命名为CD278。ICOS配体（ICOS ligand,ICOSL）即B7H2（B7 homologue 2）, 命名为CD275。以往认为, ICOS主要表达在Th2细胞。实际上, 形态学上早就观察到ICOS高表达于扁桃体生发中心明区顶部的T细胞。只是那时还没有认识到这群细胞其实主要是Tfh细胞。ICOSL主要表达于包括B细胞在内的APC。 毕业2.3.1ICOSL/ICOS相互作用调节Tfh和B细胞功能B细胞上ICOSL与Tfh细胞上ICOS相互作用, 对于Tfh细胞的产生和维持, 生发中心和记忆B细胞的形成发挥重要作用9,24。在体外, 来自扁桃腺中CXCR5hiICOShiCD4+细胞可有效诱导B细胞产生IgG25。ICOS/ICOSL相互作用对于Tfh表达IL21是必需的, 其机制可能是通过NFATc1来调节IL21表达9。纯合子缺乏ICOS与人普通变异免疫缺陷病（common variable immunodeficiency,CVID）有关, 患者淋巴结中GC缺如, IgM+记忆B细胞明显减少, 外周血中CXCR5+CD4+T细胞缺如9,10。 毕业 2.3.2Sanroque小鼠品系建立促进了对Roquin蛋白调节ICOS表达的认识2005年Vinuesa等采用致遗传上发生改变的乙基亚硝基脲（ethylnitrosourea）处理C57BL/6小鼠, 获得一种具有典型系统性红斑狼疮（SLE）特征的小鼠品系, 称之为sanroque小鼠。在细胞水平上发现, sanroque小鼠淋巴结中有大量的Tfh, 自发形成GC。这种突变小鼠缘于一种ICOS表达的抑制物的缺陷, 从而使Tfh表达高水平的ICOS, 并分泌大量的IL21。进一步研究发现, 导致小鼠发生病理改变的突变基因是编码一种高度保守RING型泛素连接酶家族成员的Roquin（Rc3h1）。Roquin蛋白含有一个结合RNA的CCCH锌指结构, 分布在胞质RNA颗粒, 提示其可能调节mRNA的翻译和稳定性。Roquin是Tfh和自身抗体应答的一种关键负调控蛋白, sanroque小鼠Roquin发生了突变（M199R）, 影响了Roquin 螺旋结构, 不能发挥抑制ICOS表达的作用, 过多形成Tfh, 导致sanroque小鼠发生自身免疫综合征8。 毕业 2.3.3Roquin抑制自身免疫的分子机制2007年Vinuesa研究组发现Roquin抑制自身免疫的分子机制是通过限制ICOS mRNA表达实现的。正常情况下, Roquin可通过促进ICOS mRNA降解而限制ICOS表达, 在ICOS mRNA 3端非翻译区有一个保守的区域, 由47个碱基对组成, 可与T细胞表达的microRNA（包括miR101）相互补。Roquin是否直接结合mRNAs靶分子和/或结合到与靶分子互补的miRNA还不清楚26。 毕业2.4CXCR5CXCR5（CD185）最初被称为BLR1（Burkitts lymphoma receptor 1）, 1992年基因克隆成功27。其相应的配体为BCA1（B cellattracting chemokine1/CXCL13）28。CXCR5主要表达于Tfh和B细胞。 毕业2.4.1Tfh细胞表达CXCR5初始T细胞不表达CXCR5, T细胞活化后CXCR5可一过性表达, 这种活化依赖于CD28和ICOS等共刺激分子, CXCR5表达往往发生在细胞增殖和分化之前。一般认为, 完全极化的T细胞（如Th1和Th2）不表达CXCR5。在淋巴结中有一部分经抗原活化的CD4+T细胞, 表达高水平的ICOS和CD40L, 并分泌大量IL21, 发育成为Tfh。CD8+T细胞也不表达CXCR5。在活化的淋巴组织（例如扁桃腺）中, 将近50%的CD4+T细胞为CXCR5+, 并定位于生发中心。从扁桃腺中分离出来的CXCR5+CD4+T细胞可有效地辅助B细胞并使其分化为浆细胞。CD4+CXCR5+CD40LhiICOShi成为Tfh细胞重要的表型29。 毕业 2.4.2B细胞表达CXCR5在淋巴组织中, CXCR5表达于所有的成熟B细胞。由淋巴滤泡基质细胞（包括滤泡树突状细胞, FDC）所产生的CXCL13趋化因子通过与其相应受体CXCR5结合, 招引B细胞和T细胞定位于淋巴组织的滤泡区域3,30,31。 毕业3效应Tfh细胞和记忆Tfh的迁移和组织定位 毕业3.1CXCR5与Tfh和B细胞迁移到B细胞区的关系Tfh表达CXCR5是Tfh迁移到外周淋巴器官B细胞区的关键trafficking分子。此外, CXCR5也表达于B细胞, 参与外周淋巴器官中B细胞滤泡的发育。CXCR5-/-或CXCL13-/-小鼠淋巴小结结构紊乱, 淋巴结和派氏集合淋巴结数量降低30,32。虽然活化T细胞可一过性表达CXCR5, 但在T细胞中只有Tfh持续性表达CXCR5。在GC中, Tfh与B细胞相互作用有利于CXCR5持续表达。实际上, B细胞与效应T细胞的相互作用首先发生在外周淋巴器官的T细胞区。接受抗原刺激后的B细胞有两种命运: 一是迁移到淋巴小结外, 发育分化为浆细胞, 并很快分泌低亲和力抗体; 另一种归宿是同T细胞一起迁移到淋巴小结B细胞区, 并形成生发中心, 发生体细胞突变和抗体亲和力成熟。而且Tfh迁移到B细胞滤泡对GC的发育是必不可少的。初始T细胞表达CCR7和CD62L, 在高内皮微静脉（HEV）产生CCL21趋化下迁移至外周淋巴器官的T细胞区, 接受来自DC的抗原刺激。活化T细胞上调CXCR5, 赋予其迁移到淋巴小结的能力, Tfh细胞在淋巴小结中与抗原刺激过的（antigenprimed）B细胞相遇, 发生CD40CD40L依赖的B细胞的活化。Tfh是否可直接从血液进入淋巴滤泡区尚不清楚(图3)7, 9。 毕业图3Tfh细胞的分化、 迁移和组织定位（略） 毕业注: （1）由外周淋巴器官T细胞区高内皮微静脉（HEV）产生的SLC（secondarylymphoid tissue chemokine）/CCL21招引表达CCR7的初始T细胞从外周循环进入T细胞区; （2）T细胞与成熟树突状细胞（mDC）等APC相互作用后表达IL6R和IL21R, APC产生的IL6与经抗原刺激后T细胞IL6R结合; （3）活化T细胞表达高水平ICOS、 IL6R、 IL21R和CXCR5, IL6和IL21调节Tfh细胞分化时通过其受体激活STAT3, 表达有CXCR5的Tfh被滤泡基质细胞（包括FDC、 血管细胞和网状细胞）产生的BCA1（B cell attracting chemokine）/CXCL13趋化迁移到淋巴小结, 进一步形成生发中心; （4）高表达CXCR5 B细胞从T细胞区迁移到B细胞滤泡（未显示）, TfhB细胞相互作用, CD40L/CD40和ICOSL/ICOS共刺激分子以及Tfh分泌IL21, 在Tfh辅助B细胞中发挥关键作用; （5）活化B细胞发生增殖分化、 Ig类别转换和亲和力成熟。 毕业3.2记忆Tfh在外周血T细胞中约有10%为CXCR5+CD4+, 并同时表达CD62L和CCR7, 可能是Tfh来源的记忆性T细胞亚群。探讨Tfh在GC中发生应答后的转归, 与免疫记忆、 疫苗研制和自身免疫性疾病有着密切的关系。目前认为, Tfh是终未分化的T细胞亚群, 由于其高表达CD95, 易于发生凋亡。但是, 最近发现在GC应答消退后, 记忆性CXCR5+CD69+Tfh继续存在于B细胞滤泡局部, 即有一群高亲和力CXCR5+T细胞存在于表达CXCL13 FDC细胞的周围, 当发生再次免疫应答时可被重新活化。显然Tfh的免疫记忆不同于其他T细胞亚群。局部环境的因素与Tfh记忆细胞存在密切相关。在B细胞滤泡中的记忆Tfh细胞还会接受来自B细胞和其他APC细胞的抗原刺激, 但这些刺激的强度尚不足于诱导效应Tfh表达ICOS和IL21的分泌。其他T细胞亚群如效应Th1和CD8+T细胞大都定位于外周的组织和炎症损伤部位, 而效应和记忆的Tfh主要定位于淋巴样组织, 尤其在B细胞滤泡33。淋巴滤泡中记忆Tfh细胞还可调节记忆B细胞功能, 使其保持长时间体液免疫应答能力。 毕业