高效液相色谱培训教材

我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：方法 项目 数量1985 年版 1990 年版 1995 年版 2000 年版HPLC 法 鉴别 9 34 150检查 12 40 160含量测定 7 60 117 387鉴于 HPLC 应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用 HPLC.I概论一、液相色谱理论发展简况一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在 1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法（Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又 因 分 析 速 度 快 而 称 为 高 速 液 相 色 谱 法(High Speed LiquidChromatography，HSLP）。也称现代液相色谱。二、二、HPLCHPLC的特点和优点的特点和优点 HPLC 有以下特点：高压压力可达 150300 Kg/cm2.色谱柱每米降压为 75 Kg/cm2 以上。高速-流速为 0。110.0 ml/min.高效可达 5000 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 100 种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点：速度快通常分析一个样品在 1530 min，有些样品甚至在 5 min 内即可完成.分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高紫外检测器可达 0。01ng，荧光和电化学检测器可达 0。1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三、色谱法分类三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物.GC 根据固定相不同又可分为气固色谱法（GSC）和气液色谱法(GLC），其中以 GLC 应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC 同样可分为液固色谱法（LSC)和液液色谱法（LLC）。此外还有超临界流体色谱法（SFC),它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相)为流动相（常用 CO2），因其扩散系数大,能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色谱法（AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC）、排阻色谱法（EC,又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法.（此外还有电泳.）按操作形式可分为纸色谱法(PC）、薄层色谱法(TLC）、柱色谱法。四、色谱分离原理四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1 1液固色谱法液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度 510m。适用于分离分子量 2001000 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾.常用于分离同分异构体。2 2液液色谱法液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和,以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化.由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相,如 C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法(RPC)。正相色谱法正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）;流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间.常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法反相色谱法一般用非极性固定相（如 C18、C8）;流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物.RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用的 80%左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大,现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离,常用缓冲液控制流动相的 pH 值.但需要注意的是，C18 和 C8 使用的 pH 值通常为 2.57.5(28），太高的 pH 值会使硅胶溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在 pH 1。510 范围操作.正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法正相色谱法 反相色谱法反相色谱法固定相极性 高中 中低流动相极性 低中 中高组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3 3离子交换色谱法离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）.被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离.缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH 值和离子强度影响.pH 值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用.流动相的盐浓度大，则离子强度高,不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。4 4 离子对色谱法离子对色谱法又称偶离子色谱法,是液液色谱法的分支.它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善.主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用 ODS 柱（即 C18)，流动相为甲醇-水或乙腈水，水中加入 310 mmol/L 的离子对试剂,在一定的 pH 值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其 pH 值、离子强度有关。5 5排阻色谱法排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出.它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等.