第十九章-药物研究的生物化学基础-课件

生物药物生物药物主要包括生化药物、微生物药物、生主要包括生化药物、微生物药物、生物技术药物和生物制品。物技术药物和生物制品。制造技术的特点：制造技术的特点：1.目的物存在于组成非常复杂的生物材料中目的物存在于组成非常复杂的生物材料中 一种生物材料含有成千上万种成分，各种化合物一种生物材料含有成千上万种成分，各种化合物的形状、大小、分子形式和理化性质各不相同，其中的形状、大小、分子形式和理化性质各不相同，其中不少还是未知物，而且有效物质在制备过程尚处于代不少还是未知物，而且有效物质在制备过程尚处于代谢动态中，故常常无固定工艺可循。谢动态中，故常常无固定工艺可循。2.有些目的物在生物材料中含量极微有些目的物在生物材料中含量极微 只达万分之一、十万分之一、甚至百万分之一，因只达万分之一、十万分之一、甚至百万分之一，因此分离纯化步骤多，难于获得高收率。此分离纯化步骤多，难于获得高收率。3.生物活性成分易变性、破坏生物活性成分易变性、破坏4.生物药物制造受理化因素和生物学因素影响生物药物制造受理化因素和生物学因素影响 生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，分离生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，分离过程必须十分小心，以保护有效物质的生物活性。过程必须十分小心，以保护有效物质的生物活性。以致许多工艺设计理论性不强以致许多工艺设计理论性不强 制造工艺几乎都在溶液中进行制造工艺几乎都在溶液中进行 温度、温度、pH、离子强度、离子强度 对溶液中各种组分的综合影响常常难于固定对溶液中各种组分的综合影响常常难于固定5.生物药物常采用生物药物常采用“多阶式多阶式”法法纯化一种有效物质常常要联用几个，甚至十几个步纯化一种有效物质常常要联用几个，甚至十几个步骤并变换不同类型的分离方法交互进行才能达到目骤并变换不同类型的分离方法交互进行才能达到目的。的。为了保护目的物的活性及结构完整性为了保护目的物的活性及结构完整性即即“逐级分离逐级分离”法。法。6.生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念 不完全相同不完全相同生物大分子类药物的分离纯化主要原理是：生物大分子类药物的分离纯化主要原理是：1）根据分子形状和分子大小不同的分离方法）根据分子形状和分子大小不同的分离方法如，差速离心，超速离心，膜分离透析。电如，差速离心，超速离心，膜分离透析。电透析、超滤和凝胶过滤等。透析、超滤和凝胶过滤等。2）根据分子电离性质（带电性）不同的分离方法）根据分子电离性质（带电性）不同的分离方法如，离子交换法、电泳法和电聚焦法等。如，离子交换法、电泳法和电聚焦法等。3）根据分子极性大小与溶解度不同的分离方法）根据分子极性大小与溶解度不同的分离方法如，溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、如，溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂分级沉淀盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂分级沉淀法。法。4）根据配基特异性不同的分离方法）根据配基特异性不同的分离方法 亲和层析亲和层析 是指利用生物细胞的代谢反应（更多的是利用微生是指利用生物细胞的代谢反应（更多的是利用微生物转化反应）来合成化学方法难于合成的药物或药物物转化反应）来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。中间体。生物合成：生物合成：微生物转化反应：微生物转化反应：是指利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应，是指利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。行催化反应，以生成所需要的活性物质。微生物转化产物特点：微生物转化产物特点：转化条件温和转化条件温和 具有立体构型单一具有立体构型单一 公害少公害少 后处理简便后处理简便 能进行某些化学反应难于进行能进行某些化学反应难于进行或不能合成的反应或不能合成的反应 为此，在制药工业中得到愈来愈广泛的应用，现已形为此，在制药工业中得到愈来愈广泛的应用，现已形成一个以遗传工程为指导，以发酵工程为基础，包括细胞成一个以遗传工程为指导，以发酵工程为基础，包括细胞工程和酶工程有机结合的生物合成技术体系，工程和酶工程有机结合的生物合成技术体系，半合成技术：半合成技术：1）药物其部分结构由天然资源得到）药物其部分结构由天然资源得到化学合成法制得最终产品化学合成法制得最终产品2）化学合成的中间产物）化学合成的中间产物微生物转化法获得最终有效化合物微生物转化法获得最终有效化合物 生物技术（生物技术（biotechnology）又称为生物工程（又称为生物工程（bioengineering），是利用），是利用生物有机体（动物、植物和微生物）或其组成部生物有机体（动物、植物和微生物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新产品或新工艺的一种技术体系。产品或新工艺的一种技术体系。包括：包括：发酵工程发酵工程基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程 基因工程技术的定义基因工程技术的定义 用人工方法，提取或制备某种细胞的某用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的工程技术。人们所需的产物的工程技术。细胞工程的定义细胞工程的定义 应用细胞生物学和分子生物学的方法应用细胞生物学和分子生物学的方法,通过类通过类似于工程学的步骤似于工程学的步骤,在细胞整体水平或细胞器水平在细胞整体水平或细胞器水平上按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获上按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。其技术涉及细胞融合技术、细胞拆和技术、术。其技术涉及细胞融合技术、细胞拆和技术、染色体导入技术、基因转移技术、胚胎移植技术、染色体导入技术、基因转移技术、胚胎移植技术、细胞与组织培养技术等。细胞与组织培养技术等。酶工程的定义酶工程的定义 在酶反应器中在酶反应器中,利用酶的生物催化作用利用酶的生物催化作用,生产出生产出人类所需要产品的一门科学技术。例如过去蔗糖人类所需要产品的一门科学技术。例如过去蔗糖几乎全部通过加工甘蔗或甜菜获得几乎全部通过加工甘蔗或甜菜获得,但现在科学家但现在科学家利用利用-淀粉酶等多种酶的催化作用淀粉酶等多种酶的催化作用,在酶反应器在酶反应器中将淀粉转化成和蔗糖具有同样甜度的高果糖浆中将淀粉转化成和蔗糖具有同样甜度的高果糖浆。发酵工程发酵工程 发酵工程也称为微生物工程，是在最适合条发酵工程也称为微生物工程，是在最适合条件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品的一种生物工艺。的一种生物工艺。单克隆抗体技术单克隆抗体技术 现代生物技术核心现代生物技术核心重组重组DNA技术技术生物工程药物生物工程药物 是指运用重组是指运用重组DNA技术和单克隆抗体技术技术和单克隆抗体技术生产的多肽、蛋白质、激素和酶类药物以及生产的多肽、蛋白质、激素和酶类药物以及疫苗、单抗和细胞生长因子类药物。疫苗、单抗和细胞生长因子类药物。工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产基因工程是生物技术中最重要的一种。基因工程是生物技术中最重要的一种。目的基因制备目的基因制备载体的选择和制备载体的选择和制备DNA片段重组连接片段重组连接重组重组DNA导入受体细胞导入受体细胞转化子的筛选转化子的筛选DNA重组体的筛选重组体的筛选DNA重组体的鉴定重组体的鉴定 (一一)基因载体基因载体（VectorVector）一个理想的载体应具备以下几个条件：一个理想的载体应具备以下几个条件：（a a）本身是一个复制子，能自我复制。载体在进入受体细胞后，）本身是一个复制子，能自我复制。载体在进入受体细胞后，可自身复制或插入到基因组中，随受体细胞的基因组一起复制。可自身复制或插入到基因组中，随受体细胞的基因组一起复制。（b b）分子量小，小分子的）分子量小，小分子的DNADNA制备时不易损伤，小分子制备时不易损伤，小分子DNADNA限制酶限制酶的切点少。的切点少。（c c）目的基因与载体连结后，可在受体细胞内转录，翻）目的基因与载体连结后，可在受体细胞内转录，翻 译成蛋白质产物（表达载体）。译成蛋白质产物（表达载体）。（d d）能给寄主（受体）细胞提供可选择的标记：如抗药性，营养）能给寄主（受体）细胞提供可选择的标记：如抗药性，营养缺陷型或显色表型等，以利于筛选。缺陷型或显色表型等，以利于筛选。（E）具有多克隆位点，便于目的基因片段与载体连接。）具有多克隆位点，便于目的基因片段与载体连接。(F)拷贝数多，便于分离提纯。拷贝数多，便于分离提纯。2、载体的分类、载体的分类 克隆载体克隆载体 表达载体表达载体 转移载体转移载体 探针载体探针载体 质粒（质粒（plasmidplasmid）载体）载体 噬菌体载体：如噬菌体载体：如噬菌体载体、噬菌体载体、M13M13噬菌体载体噬菌体载体 杂合载体杂合载体 (如粘粒如粘粒cosmidcosmid)病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等 人工染色体载体人工染色体载体3 3、克隆载体（、克隆载体（cloning vectorcloning vector）（a a）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制。）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制。复制起点复制起点 OriOri 复制区复制区 复制终点复制终点 termterm （b b）带有抗药性基因）带有抗药性基因 TetTet r r：编码膜蛋白，阻止：编码膜蛋白，阻止TetTet进入细胞进入细胞 Amp Amp r r：-内酰胺环水解酶。内酰胺环水解酶。Kan Kan r r：KanKan P ,neoP ,neo p p Cam Cam r r：氯霉素乙酰基转移酶：氯霉素乙酰基转移酶 载体上含有的一个人工合成的载体上含有的一个人工合成的DNADNA片段，其上片段，其上含有数个单一酶切位点，是外源含有数个单一酶切位点，是外源DNADNA的插入部位的插入部位 是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点组成。这些位点在载体上都是单一位点pBR322质粒质粒 有两个抗药性基因，每个抗性基因中均含有单有两个抗药性基因，每个抗性基因中均含有单克隆位点，外源克隆位点，外源DNA插入后使相应的抗性基因失活，插入后使相应的抗性基因失活，宿主细胞失去相应的抗药性，不能在含相应抗生素宿主细胞失去相应的抗药性，不能在含相应抗生素的培养基中生长，这一现象称为插入失活。的培养基中生长，这一现象称为插入失活。质粒质粒pBR322的抗性基因筛选示意图的抗性基因筛选示意图4、表达载体（、表达载体（expressing vector）结构：结构：克隆载体克隆载体 +表达构件表达构件 原核生物表达原核生物表达 真核生物表达真核生物表达 ori ampr 基础上加转录和翻译相关基础上加转录和翻译相关element MCS 表达载体表达载体=克隆载体克隆载体+表达元件表达元件 “启动子启动子核糖体结合位点核糖体结合位点克隆位点克隆位点转录终止信号转录终止信号”原核表达载体结构示意图原核表达载体结构示意图(3)(3)哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体（1）病毒载体）病毒载体 整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如的染色体整合。如pSV系列载体系列载体 游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒和在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒和逆转录病毒等。逆转录病毒等。（2）质粒载体）质粒载体 常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和 筛选标记，又含真核的复制位点筛选标记和表达构筛选标记，又含真核的复制位点筛选标记和表达构件。件。1.直接从染色体直接从染色体DNA分离分离 如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。2.化学合成化学合成要求：要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列的氨基酸序列 基因小基因小 将不同细胞类型或不同阶段细胞的将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA后后,将所有将所有cDNAcDNA混合体混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为子克隆的混合体称为 cDNAcDNA文库。文库。mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制*从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T 采用限制酶将基因组采用限制酶将基因组DNADNA切成片段，每一个切成片段，每一个DNADNA片段都片段都与一个载体分子拼接成重组与一个载体分子拼接成重组DNADNA，然后将所有的重组体都，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。基因片段。从细胞中分离基因组从细胞中分离基因组DNADNA、用、用SauSau3A3A或或MboMboI I部分消化、部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库：文库：存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合*从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因 根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组基因组DNADNA为模板经为模板经PCRPCR扩增目的基因。扩增目的基因。以以mRNAmRNA或或RNARNA为模板经为模板经RT-PCRRT-PCR扩增目的基因。扩增目的基因。（三）限制酶的应用限制酶的应用 限制酶限制酶(restriction enzyme):(restriction enzyme):一类专门切割一类专门切割DNADNA的酶。是的酶。是一类能识别双链一类能识别双链DNADNA分子中分子中 的某种特定核苷酸序列，并与其的某种特定核苷酸序列，并与其特异结合，并在识别位点或其周围切割双链特异结合，并在识别位点或其周围切割双链DNADNA的一类核酸的一类核酸内切酶。内切酶。1.定义：定义：2.限制酶的识别和切割位点限制酶的识别和切割位点识别：识别：4 46 6 碱基对，多具有回文结构碱基对，多具有回文结构（palindrom），），少数识别长序少数识别长序列为列为8 8个或个或8 8个以上碱基对，有的存在简并序列（个以上碱基对，有的存在简并序列（有的核苷酸位点可以有的核苷酸位点可以不同不同 ）。）。Sau3AI EcoRI Pst Sma5 GATC GAATTC CTGCAG CCCGGG 33 CTAG CTTAAG GACGTC GGGCCC 5 简并序列：简并序列：GTYRAC Y=C/T R=G/A YR=CG/CA/TG/TA Hind可识别可识别4个特定序列个特定序列 3.限制酶的切割方式限制酶的切割方式(1)(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单链识别序列内两条链上交错切割，产生单链突出的粘性末端突出的粘性末端(2)(2)对称处同时切断对称处同时切断DNADNA的两条链，产生平端的两条链，产生平端DNADNA片段片段4.限制酶的切割结果限制酶的切割结果切割的结果：切割的结果：产生三种不同的末端产生三种不同的末端 平末端平末端 blunt end 5突出突出 5-protruding（cohesive end）3突出突出 3-protruding（overhang tail）切割的化学本质：切割的化学本质：磷酸二酯键的断裂磷酸二酯键的断裂,形成含形成含5 P和和3OH 末端的两个末端的两个DNA片段。片段。对一特定的对一特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则切点数而言，识别序列碱基对少的，则切点数多，产生的片段小。多，产生的片段小。用同一种酶裂解后，产生相用同一种酶裂解后，产生相同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键结合，在结合，在T T4 4DNADNA连接酶的作用下，共价闭合。连接酶的作用下，共价闭合。（双酶切）（双酶切）（单酶切）（单酶切）措施：措施：载体酶切后，用载体酶切后，用APAP（碱性磷酸酶）水解（碱性磷酸酶）水解55端的端的磷酸基团防止载体的自身环化。磷酸基团防止载体的自身环化。G G A T C CC C T A G GBamH 的 识 别 序列 及 切 割 部 位G G A T C CC C T A G GBamH含 目 的 基 因 的 DNA片 段BamHGC C T A G535335535353G G A T C CC C T A G G G A T C C G目 的 基 因 片 段混 合、退 火G C C T A G G A T C C G G A T C C GG C C T A G质 粒 载 体含 目 的 基 因 的 重 组 质 粒G C C T A G G A T C C GDNA连 接 酶双酶切双酶切DNADNA片段粘性末端的连接片段粘性末端的连接 G G A T C CC C T A G GBamHBamHBamHG C C T A G53535553533G A A T T CC T T A A G A A T T C G目 的 基 因 片 段混 合、退 火G C T T A A G A T C C G A A T T C GG C C T A G重 组 质 粒DNA连 接 酶EcoRIEco RI5 G A T C C G G C T T A A A A T T C G G C C T A G G A T C C G G C T T A AEcoRI GATCC G G CCTAG35载 体不同方式产生的平端不同方式产生的平端DNADNA片段可以在片段可以在T4DNAT4DNA连接酶的作用下，与某些限制酶产连接酶的作用下，与某些限制酶产生的平端载体相连接。在连接时，所用的生的平端载体相连接。在连接时，所用的ATPATP及及T4DNAT4DNA连接酶的浓度要比连接粘末端连接酶的浓度要比连接粘末端的高些。的高些。以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNADNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（此过程又叫转导（transductiontransduction）。）。原位原位杂交杂交基因工程的基本过程基因工程的基本过程单克隆抗体（单克隆抗体（biotechnology）是由一个杂交瘤细胞及其后代产生的抗体，是由一个杂交瘤细胞及其后代产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。具有单一、特异与纯化的特性。单克隆抗体主要用于免疫诊断、定向给药及单克隆抗体主要用于免疫诊断、定向给药及家庭诊断检测试剂盒的配制，在治疗上也具有良家庭诊断检测试剂盒的配制，在治疗上也具有良好应用前景。好应用前景。抗原注入小鼠体内用PEG促使细胞融合得到杂交瘤细胞收集骨髓瘤细胞分离受免淋巴细胞培养骨髓培养骨髓瘤细胞瘤细胞 单抗产品单抗产品 单抗产品单抗产品在HAT培养基中培养克隆杂交瘤细胞扩大组织培养或生成腹水瘤分离纯化筛选产生专一抗体的杂交瘤细胞分离纯化杂交瘤细胞与杂交瘤细胞与单克隆抗体制单克隆抗体制造示意图造示意图生化分析法的优点：生化分析法的优点：操作简便，取样少，灵敏度高，专一性强。操作简便，取样少，灵敏度高，专一性强。微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法 测定含氮有机药物测定含氮有机药物酶法酶法 分析具有旋光异构体或几何异分析具有旋光异构体或几何异构体的药物构体的药物免疫法免疫法 分析具有抗原或半抗原性质的药物分析具有抗原或半抗原性质的药物 放射酶法放射酶法 检测微生物药品等检测微生物药品等（一）免疫分析法（一）免疫分析法 基于抗原抗体特异性结合反应发展起来的分析基于抗原抗体特异性结合反应发展起来的分析方法。方法。1.免疫扩散法免疫扩散法 2.免疫电泳法免疫电泳法 3.放射免疫测定法（放射免疫测定法（RIA）4.酶联免疫测定法（酶联免疫测定法（ELISA）1.免疫扩散法免疫扩散法 本法可用于未知样品的抗原组成及不同样品本法可用于未知样品的抗原组成及不同样品的抗原特性比较鉴定。的抗原特性比较鉴定。2.免疫电泳法免疫电泳法 本法可用以检查抗原制剂的纯度和分析抗原混合本法可用以检查抗原制剂的纯度和分析抗原混合物的组分。物的组分。3.放射免疫测定法（放射免疫测定法（RIA）Ag-AbAgAg*-Ab AbAg*4.酶联免疫测定法（酶联免疫测定法（RIA）（二）电泳分析法（二）电泳分析法 电泳是带点颗粒在电场作用下，向着电泳是带点颗粒在电场作用下，向着与其所带电荷相反的电极方向移动。与其所带电荷相反的电极方向移动。各种物质由于所带净电荷的种类和数各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可以对物质进不同。利用物质的这种性质可以对物质进行分离和鉴定。行分离和鉴定。电泳分析法电泳分析法 影响颗粒电泳迁移率的因素主要有：影响颗粒电泳迁移率的因素主要有：1.缓冲液的种类和性质缓冲液的种类和性质 2.电场电场3.支持介质支持介质（三）酶法分析（三）酶法分析 酶法分析的原理是借助酶促反应（包括单酶酶法分析的原理是借助酶促反应（包括单酶或多酶耦联反应）对酶或酶所作用的底物或参与或多酶耦联反应）对酶或酶所作用的底物或参与酶促反应的辅酶、激动剂和抑制剂等进行定性、酶促反应的辅酶、激动剂和抑制剂等进行定性、定量分析。定量分析。酶法分析的特点酶法分析的特点酶法分析主要有三类测定法：酶法分析主要有三类测定法：1.中止反应法中止反应法2.连续测定法连续测定法3.循环放大法循环放大法（一）多肽与蛋白质类药物的主要分析方法（一）多肽与蛋白质类药物的主要分析方法1.蛋白质药物的纯度分析蛋白质药物的纯度分析 蛋白质纯度一般是指样品有无含其他杂蛋白，而不蛋白质纯度一般是指样品有无含其他杂蛋白，而不包括盐类、缓冲液离子、包括盐类、缓冲液离子、SDS等小分子在内。等小分子在内。蛋白质纯度检测方法：蛋白质纯度检测方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS-PAGE毛细管电泳（毛细管电泳（CE）等点聚焦（等点聚焦（IEF）HPLC（包括凝胶排阻层析，各种反相（包括凝胶排阻层析，各种反相HPLC，离子交换色谱，疏水色谱等）离子交换色谱，疏水色谱等）化学法化学法2.多肽与蛋白质的分子量的测定多肽与蛋白质的分子量的测定3.蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定4.生物质谱法生物质谱法（二）核酸类药物的主要分析方法（二）核酸类药物的主要分析方法 核酸、核苷酸及其衍生物的分子中含有碱基，具有核酸、核苷酸及其衍生物的分子中含有碱基，具有共轭双键结构，对紫外光有特征吸收，共轭双键结构，对紫外光有特征吸收，RNA和和DNA对对紫外光的特征吸收位于紫外光的特征吸收位于260nm处。处。核酸分子中含有碱基、戊糖和磷酸。定量核酸核酸分子中含有碱基、戊糖和磷酸。定量核酸的方法可测定三者中任何一种，从而计算样品中的的方法可测定三者中任何一种，从而计算样品中的核酸含量。核酸含量。每每1ml含含1g RNA 溶液的光吸收值为溶液的光吸收值为0.022，每每1ml含含1g DNA 溶液的光吸收值为溶液的光吸收值为0.020。1.紫外分光光度法测定紫外分光光度法测定RNA与与DNA含量含量 当当RNA与浓盐酸在与浓盐酸在100下煮沸后，即发生降下煮沸后，即发生降解产生核糖，并进而转变为糠醛，在解产生核糖，并进而转变为糠醛，在FeCl3或或CuCl2催化下，糠醛与催化下，糠醛与3，5-二羟基甲苯（地衣酚二羟基甲苯（地衣酚）反应）反应生成绿色复合物，在生成绿色复合物，在670nm处有最大吸收。处有最大吸收。2.地衣酚显色法测定地衣酚显色法测定RNA3.二苯胺法测定二苯胺法测定DNA含量含量（三）酶类药物的分析（三）酶类药物的分析 酶类药物的主要质量指标是它的催化活力。酶类药物的主要质量指标是它的催化活力。适宜的测定酶活力的方法至少适宜的测定酶活力的方法至少应满足如下条件：应满足如下条件：1.有可被检测且能反映酶反应进行程度的信号物有可被检测且能反映酶反应进行程度的信号物2.底物对酶远远过量底物对酶远远过量3.适宜的反应温度适宜的反应温度4.最适的最适的pH反应体系反应体系5.被测的酶量适当被测的酶量适当6.测定时间在酶促反应初速度范围内。测定时间在酶促反应初速度范围内。（四）重组（四）重组DNA药物中的可能杂质检查药物中的可能杂质检查1.外源性外源性DNA重组重组DNA药物中残留的外源性药物中残留的外源性DNA来源来源于宿主细胞，每种制品都有其独特的残留于宿主细胞，每种制品都有其独特的残留DNA，因此产品中必须控制外源性，因此产品中必须控制外源性DNA残留残留量。量。测定残留测定残留DNA的有效方法：的有效方法：DNA分子杂交技术。2.宿主细胞蛋白质宿主细胞蛋白质宿主细胞蛋白质简称宿主蛋白，是指生宿主细胞蛋白质简称宿主蛋白，是指生成过程中来自宿主或培养基中的残留蛋白或成过程中来自宿主或培养基中的残留蛋白或多肽等杂质。多肽等杂质。测定制品中宿主蛋白含量的方法：测定制品中宿主蛋白含量的方法：酶联免疫吸附测定法（ELISA）；Western blot 法。.二聚体或多聚体的测定二聚体或多聚体的测定一般采用分子排阻色谱法测定二聚体或一般采用分子排阻色谱法测定二聚体或多聚体的含量限度。多聚体的含量限度。4.降解产物的测定降解产物的测定鉴于降解产物的基本结构通常与未降解鉴于降解产物的基本结构通常与未降解的重组药物相似，因此，对降解产物的测定的重组药物相似，因此，对降解产物的测定多采用离子对反相色谱。多采用离子对反相色谱。一、一、药物作用的生物化学基础药物作用的生物化学基础（一）神经传导与神经递质（一）神经传导与神经递质 当两个神经元的突触当两个神经元的突触20nm时，动作电位仍时，动作电位仍可使突触后膜去极化，神经冲动继续向下传递。可使突触后膜去极化，神经冲动继续向下传递。如裂隙如裂隙 20nm时，就必须由神经递质来传时，就必须由神经递质来传递信息。递信息。神经递质神经递质(突触分泌信号突触分泌信号)：神经元突触前膜释放神经元突触前膜释放起着信息传递作用的物质称为神经递质。（二）受体的结构与功能（二）受体的结构与功能 细胞中能识别配体并与其特异性结合，引起细胞中能识别配体并与其特异性结合，引起各种生物效应的分子称为各种生物效应的分子称为受体受体。为蛋白质，部分为糖蛋白或脂蛋白。为蛋白质，部分为糖蛋白或脂蛋白。受体的化学本质：受体的化学本质：1.受体受体 离子通道型离子通道型受体本身构成离子通道。受体本身构成离子通道。当受体的调节部位与配体结合后，受体变构，使当受体的调节部位与配体结合后，受体变构，使通道开放或关闭、引起或切断阳离子、阴离子的流通道开放或关闭、引起或切断阳离子、阴离子的流动，从而传递信息。动，从而传递信息。2.受体受体 G蛋白蛋白-效应蛋白型效应蛋白型 在真核细胞，鸟苷三磷酸在真核细胞，鸟苷三磷酸-结合蛋白（结合蛋白（G蛋白）在蛋白）在联系细胞膜受体与效应蛋白质中起着重要的介导作联系细胞膜受体与效应蛋白质中起着重要的介导作用。用。3.受体受体 酪氨酸蛋白激酶型酪氨酸蛋白激酶型4.受体受体 转录因子型转录因子型（三）药物作用的靶酶（三）药物作用的靶酶 药物对靶酶的作用：药物对靶酶的作用：一是调节酶量一是调节酶量（酶的合成增加或减少）（酶的合成增加或减少），二是调节酶活力（二是调节酶活力（激动剂、抑制剂、辅酶或活力调节）激动剂、抑制剂、辅酶或活力调节）。有些重要治疗剂的作用在于它们能选择性有些重要治疗剂的作用在于它们能选择性地抑制一种靶酶。地抑制一种靶酶。一种酶抑制剂要成为应用于临床的有效药物一种酶抑制剂要成为应用于临床的有效药物应具备以下条件：应具备以下条件：1.被抑制的靶酶所催化的生化反应与某种疾病的发生被抑制的靶酶所催化的生化反应与某种疾病的发生 有关，在患者体内这一生化途径的抑制具有治疗意义。有关，在患者体内这一生化途径的抑制具有治疗意义。2.这种酶抑制剂必须具有特异性，在治疗剂量内不对其它代谢途这种酶抑制剂必须具有特异性，在治疗剂量内不对其它代谢途径或受体发生抑制作用。径或受体发生抑制作用。3.这种抑制剂应具有某种药动学特征，如可被吸收并渗透到作这种抑制剂应具有某种药动学特征，如可被吸收并渗透到作用部位和具有合理，可预见的量效关系及作用持续时间。用部位和具有合理，可预见的量效关系及作用持续时间。4.抑制剂对人体毒性较小，疗效指数高。抑制剂对人体毒性较小，疗效指数高。5.抑制剂应符合药品标准。工艺、质量与价格在临床上与市场抑制剂应符合药品标准。工艺、质量与价格在临床上与市场上具有竞争性。上具有竞争性。（四）细胞生长调节因子（四）细胞生长调节因子 细胞生长调节因子系在体内和体外对效应细胞的生细胞生长调节因子系在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类生理活性物质，其长、增殖和分化起调控作用的一类生理活性物质，其中大多数是蛋白质或多肽，亦有非蛋白质物质。中大多数是蛋白质或多肽，亦有非蛋白质物质。许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，它们是许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，它们是一类分泌性、可溶性介质，仅微量就具有生物活性。一类分泌性、可溶性介质，仅微量就具有生物活性。细胞生长调节因子分为：细胞生长调节因子分为：1.细胞生长刺激因子类：细胞生长刺激因子类：如：促红细胞生长因子与集落细胞刺激 因子等造血 细胞生长因子和表皮生长因子、纤维细胞生长 因子、神经生长因子、白细胞介素118、骨生长 因子等。2.细胞生长抑制因子类：细胞生长抑制因子类：如：如干扰素（、），肿瘤坏死因子、，转化生长因子（TGFS），肝增殖抑制因子等。二、二、新药物筛选的生物化学方法新药物筛选的生物化学方法 研究治疗某种疾病的药物，首先要有能反映预研究治疗某种疾病的药物，首先要有能反映预期药理作用的筛选模型。新药筛选模型可以是整期药理作用的筛选模型。新药筛选模型可以是整体动物或是细胞、亚细胞或分子水平。生物化学体动物或是细胞、亚细胞或分子水平。生物化学理论与实验方法常常成为新药筛选与药效学研究理论与实验方法常常成为新药筛选与药效学研究的技术手段。的技术手段。（一）放射配基受体结合法（一）放射配基受体结合法（RRA）（二）酶学实验法（二）酶学实验法在药物代谢中起关键作用的酶是肝脏细胞色素在药物代谢中起关键作用的酶是肝脏细胞色素P450系统。系统。其主要技术：其主要技术：制备肝微粒体和线粒体用于体外药物代谢研究；制备肝微粒体和线粒体用于体外药物代谢研究；用诱导肝脏药物酶的方法研究药物对肝脏药物酶的影响用诱导肝脏药物酶的方法研究药物对肝脏药物酶的影响；观察药物对细胞色素观察药物对细胞色素P450活性及含量的影响以及药物与活性及含量的影响以及药物与 P450结合后的光谱分析；结合后的光谱分析；测定药物受肝脏药物代谢酶的水解作用和药物经葡萄糖测定药物受肝脏药物代谢酶的水解作用和药物经葡萄糖 醛酸转移酶、谷胱甘肽醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶的作用所产生的结合反转移酶的作用所产生的结合反 应等。应等。（三）膜功能研究方法（三）膜功能研究方法 在药理学研究中有代表性的膜制备技术与功能研究在药理学研究中有代表性的膜制备技术与功能研究方法常见的有：方法常见的有：1.钙调蛋白钙调蛋白-红细胞膜的制备及钙调蛋白功能测定红细胞膜的制备及钙调蛋白功能测定 应用高速离心法制备的红细胞膜含有应用高速离心法制备的红细胞膜含有Ca2+、Mg2+-ATP酶是一种与钙离子转运密切相关的酶是一种与钙离子转运密切相关的CaM靶酶。通过测定靶酶。通过测定CaM激活激活Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的变化可观察钙拮抗剂类酶活性的变化可观察钙拮抗剂类药物的药理活性。药物的药理活性。2.心肌细胞膜的制备与功能测定心肌细胞膜的制备与功能测定 应用差速离心法制备的心肌细胞膜可作为膜上酶的活性应用差速离心法制备的心肌细胞膜可作为膜上酶的活性的测定材料。的测定材料。强心甙，某些抗心律失常药和强心甙，某些抗心律失常药和-肾上腺能阻断药的作用肾上腺能阻断药的作用机制都与心肌细胞膜上的机制都与心肌细胞膜上的Na+、K+-ATP酶或腺苷酸环化酶酶或腺苷酸环化酶以及膜上专一性受体的功能有关。以及膜上专一性受体的功能有关。因此，心肌细胞膜的功能分析可供这类药物的筛选研究。因此，心肌细胞膜的功能分析可供这类药物的筛选研究。（四）生化代谢功能分析法（四）生化代谢功能分析法 体内存在着一整套复杂又十分完整的代谢调节网络，体内存在着一整套复杂又十分完整的代谢调节网络，各种代谢相互联系，有序进行。各种代谢相互联系，有序进行。整体的神经整体的神经-体液调节体液调节 细胞及其关键酶的调节细胞及其关键酶的调节生化代谢功能分析的目的：生化代谢功能分析的目的：是研究纠正代谢紊乱与失调药物的有效实是研究纠正代谢紊乱与失调药物的有效实验方法。验方法。1.降血糖药物实验法：降血糖药物实验法：2.调血脂药及抗动脉粥样硬化药实验法：调血脂药及抗动脉粥样硬化药实验法：1）喂养法）喂养法抗动脉粥样硬化药的筛选模型主要有：抗动脉粥样硬化药的筛选模型主要有：2）免疫学方法）免疫学方法3.凝血药和抗凝血药实验法凝血药和抗凝血药实验法（五）逆向药理学（五）逆向药理学 以往的药理学研究模式：以往的药理学研究模式：先发现作用于某一类受体或受体亚型的药物先发现作用于某一类受体或受体亚型的药物 （确定受体的存在）（确定受体的存在）分离受体分离受体 （研究受体的相关基因家族）（研究受体的相关基因家族）即：配基（药物）即：配基（药物）受体受体 基因模式基因模式逆向药理学研究模式：逆向药理学研究模式：即：即：受体受体 基因基因配基（药物）配基（药物）药物设计是新药研究的重要内容，是研究和药物设计是新药研究的重要内容，是研究和开发新药的重要手段和途径。开发新药的重要手段和途径。所谓药物设计是通过科学的构思与科学的所谓药物设计是通过科学的构思与科学的方法，提出具有特定药理活性的新化学实体或方法，提出具有特定药理活性的新化学实体或新化合物结构。新化合物结构。一、一、酶与药物设计酶与药物设计 一些重要治疗药物的作用机制就在于它们抑制一些重要治疗药物的作用机制就在于它们抑制了一种靶酶，靶酶有的存在于正常人体组织中，了一种靶酶，靶酶有的存在于正常人体组织中，有的存在于感染人体的病原体内。有的存在于感染人体的病原体内。（可逆性胆碱酯酶抑制剂）毒扁豆碱毒扁豆碱 抑制抑制乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶抑制抑制乙酰胆碱乙酰胆碱阻止其水解，阻止其水解，延长其效应。延长其效应。毒扁豆碱起着拟胆碱剂的作用，主要用于青光眼缩瞳作用。毒扁豆碱起着拟胆碱剂的作用，主要用于青光眼缩瞳作用。磺 胺 类 药 物二氢叶酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸 谷氨酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶四氢叶酸磺磺 胺胺 类类 药药 物物抗菌增效剂抗菌增效剂TMP二、二、受体与药物设计受体与药物设计 药物受体是在分子水平上，与药物互相识别、药物受体是在分子水平上，与药物互相识别、相互作用而发生初始药理效应的生物大分子。相互作用而发生初始药理效应的生物大分子。受体的基本特征是：受体的基本特征是：1.受体具有识别特异性配体（药物）的能力，其识别受体具有识别特异性配体（药物）的能力，其识别 的基础是二者在化学结构和空间结构的互补；的基础是二者在化学结构和空间结构的互补；2.配体与受体结合后可引发生物效应，其结合具有特异配体与受体结合后可引发生物效应，其结合具有特异 性，饱和性和可逆性；性，饱和性和可逆性；3.与受体结合的配体，其生物效应可分为激动剂和拮抗剂。与受体结合的配体，其生物效应可分为激动剂和拮抗剂。（一）受体介导的靶向药物设计（一）受体介导的靶向药物设计 利用受体学说指导药物设计，目前切实可行的利用受体学说指导药物设计，目前切实可行的是受体介导的药物导向，即以受体的配体为药物载是受体介导的药物导向，即以受体的配体为药物载体，把有效药物选择性地通过受体导向特定的细胞体，把有效药物选择性地通过受体导向特定的细胞分子，以达到治疗疾病和减少毒副作用的目的。分子，以达到治疗疾病和减少毒副作用的目的。利用无药理性活性的受体配体作为药物载体，利用无药理性活性的受体配体作为药物载体，制成的靶向药物大大地增加了药物作用的选择性。制成的靶向药物大大地增加了药物作用的选择性。靶向药物按其导向机制可分为：靶向药物按其导向机制可分为：是指药物通过正常的生理转运和潴留达到靶部位。是指药物通过正常的生理转运和潴留达到靶部位。被动靶向：被动靶向：主动靶向：主动靶向：是指通过生物识别设计，如抗体识别、受体识别、是指通过生物识别设计，如抗体识别、受体识别、免疫识别等将药物导向特异靶部位。免疫识别等将药物导向特异靶部位。物理靶向：物理靶向：形象的称为形象的称为“药物导弹药物导弹”。是指通过磁场、点场、温度等因素把药物导向靶是指通过磁场、点场、温度等因素把药物导向靶部位，如磁性微球、热敏脂质体等。部位，如磁性微球、热敏脂质体等。（二）药物与受体结合的构象分析（二）药物与受体结合的构象分析 研究受体蛋白三维结构的方法有：研究受体蛋白三维结构的方法有：1.同源分子法同源分子法2.归纳法归纳法3.演绎法演绎法4.比较分子力场分析法比较分子力场分析法三、三、药物代谢转化与前体药物设计药物代谢转化与前体药物设计四、四、生物大分子的结构模拟与药物设计生物大分子的结构模拟与药物设计五、五、药物基因组学与药物研究药物基因组学与药物研究药物基因组学在以下药学领域中将获得广泛应用：药物基因组学在以下药学领域中将获得广泛应用：1.检测、评估个体对某种药物的适用程度，使药物检测、评估个体对某种药物的适用程度，使药物 的有效性达到最大化。的有效性达到最大化。2.检测药物应答基因的多态性，依据个体的遗传差异实检测药物应答基因的多态性，依据个体的遗传差异实现个性化用药。现个性化用药。3.确定疾病发生相关基因，筛选新的药物作用靶点，研确定疾病发生相关基因，筛选新的药物作用靶点，研究药物代谢酶基因谱及药物产生毒副反应的相关基因，究药物代谢酶基因谱及药物产生毒副反应的相关基因，从而提高新药开发命中率，增强药物疗效和安全性，从而提高新药开发命中率，增强药物疗效和安全性，缩短开发周期，降低研究开发成本。缩短开发周期，降低研究开发成本。