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血红蛋白醋酸纤维薄膜碱性电泳血红蛋白醋酸纤维薄膜碱性电泳实验四实验四1.1.掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作2.2.了解血红蛋白的组成及分类了解血红蛋白的组成及分类一、实验目的实验目的（Experimental Objectives）电泳电泳：指带电胶体粒子或分子在电场的指带电胶体粒子或分子在电场的作用下，作定向移动。作用下，作定向移动。由于各种物质的由于各种物质的等电点不同，在同一等电点不同，在同一P P环境中解离后所环境中解离后所带电荷性质及电量多少也各不相同带电荷性质及电量多少也各不相同,再由再由于其分子量、结构、形状大小各有差异，于其分子量、结构、形状大小各有差异，因此在同一电场中泳动速度也不一样。一因此在同一电场中泳动速度也不一样。一般来说，所带电荷多、分子量小、形状越般来说，所带电荷多、分子量小、形状越接近球形者，泳动速度快，反之则慢。接近球形者，泳动速度快，反之则慢。1 1）显微电泳显微电泳即在显微镜即在显微镜下观察胶体粒子或细胞的移动度，也下观察胶体粒子或细胞的移动度，也称细胞电泳。称细胞电泳。2 2）自由电泳自由电泳即悬浮在介即悬浮在介质中的细胞和生物大分子，在电场作质中的细胞和生物大分子，在电场作用下自由定向移动。用下自由定向移动。3 3）区域电泳区域电泳（区带电泳）：即（区带电泳）：即在不同电力条件、支持物上进行直接在不同电力条件、支持物上进行直接分离，鉴定生物物质，促使获得各自分离，鉴定生物物质，促使获得各自电荷差异的生物粒子形成各自区域以电荷差异的生物粒子形成各自区域以帯形停留在载体上。如：滤纸、淀粉、帯形停留在载体上。如：滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等，琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等，此类此类 电泳技术分离技巧简便，运用电泳技术分离技巧简便，运用十分广泛。十分广泛。4 4）免疫电泳免疫电泳：即抗原与抗体：即抗原与抗体在比例合适的琼脂糖载体中相结合的在比例合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免疫技术，亲和电泳即属此类。一种电免疫技术，亲和电泳即属此类。1.1.连续系统：连续系统：电泳缓冲液的离子成分、电泳缓冲液的离子成分、PHPH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，带电颗粒电泳时仅具有带电颗粒电泳时仅具有电荷效应电荷效应、分子筛分子筛效应效应。2.2.不连续系统：不连续系统：电泳缓冲液离子成分、电泳缓冲液离子成分、pHpH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相同，带电颗粒电泳时具有同，带电颗粒电泳时具有浓缩效应浓缩效应、电荷电荷效应效应、分子筛效应分子筛效应。血红蛋白（血红蛋白（Hb)Hb)的组成及分类：的组成及分类：血红蛋白（血红蛋白（Hb)Hb)：由：由亚铁血亚铁血红素红素、珠蛋白珠蛋白 组成组成 。每个珠蛋白分。每个珠蛋白分子由子由4 4条多肽链构成条多肽链构成 ，根据其一级结，根据其一级结构的不同可分为构的不同可分为、四种四种类型。类型。正常成人Hb种类：组成 百分含量 pIHbA 22 9598%6.95HbA2 22 23%7.38HbF 22 6.95 二、实验原理二、实验原理(Experimental Principles)在pH8.6的环境中，Hb是一种带负电荷的蛋白质（Hb的pI 8.6），在电场中向正极泳动。电泳时，由于各种Hb等电点不同，所带电荷量不同；分子量大小、形状不同，导致各自的泳动速度不同，因而被分离。这种分离可初步鉴定不同的Hb。醋酸纤维素薄膜是由纤维素醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所有生物活性物质均能通过电泳得到分有生物活性物质均能通过电泳得到分离。离。醋酸纤维素薄膜电泳因设备醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操作方便、电泳时间短、分辨简单、操作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分离清晰、无拖尾、易定率高、区带分离清晰、无拖尾、易定量等，已成为临床、实验室首选的方量等，已成为临床、实验室首选的方法法。三、实验材料、主要仪器和试剂三、实验材料、主要仪器和试剂（Equipments,Materials and AgentsEquipments,Materials and Agents）1 1、试剂、试剂 0.9%0.9%的的NaClNaCl溶液；蒸馏水；溶液；蒸馏水；四氯化碳；碘四氯化碳；碘酊；酊；75%75%酒精；酒精；TEBTEB缓冲液（缓冲液（pH8.6pH8.6）；丽春）；丽春红染液；漂洗液。红染液；漂洗液。2 2、实验器材、实验器材 醋酸纤维薄膜；滤纸；电泳仪；一次性穿刺醋酸纤维薄膜；滤纸；电泳仪；一次性穿刺针；消毒棉签。针；消毒棉签。四、操作步骤四、操作步骤（Operating Procedure）1.1.取血：取血：用用2%2%碘酊棉球消毒受试者手指，再用碘酊棉球消毒受试者手指，再用75%75%酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约50ul50ul放入放入事先已加入事先已加入0.9%NaCl 1ml0.9%NaCl 1ml 的的1.5ml1.5ml离心管中。如出血不畅，可对手指稍离心管中。如出血不畅，可对手指稍加挤压。加挤压。2.2.制备制备HbHb液：液：1 1）洗涤红细胞洗涤红细胞：将上述离心管，颠倒混：将上述离心管，颠倒混匀匀5-65-6次，次，4000rpm4000rpm，离心，离心3 3分钟。弃上分钟。弃上清，再加清，再加1ml 0.9%NaCl1ml 0.9%NaCl悬浮红细胞，悬浮红细胞，相同条件重复离心一次。相同条件重复离心一次。2 2）溶血溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水：向红细胞沉淀中加入蒸馏水1 1滴，摇匀，再加入四氯化碳滴，摇匀，再加入四氯化碳1 1滴，振荡滴，振荡混匀，相同条件再离心一次，取上清混匀，相同条件再离心一次，取上清即得即得HbHb液。液。3.3.电泳电泳1 1）膜条准备：）膜条准备：2 2）点样：）点样：取出平衡好的膜条，用滤纸吸去多余的取出平衡好的膜条，用滤纸吸去多余的液体，然后平铺液体，然后平铺,（毛面朝上毛面朝上），用小玻片沾取），用小玻片沾取适量适量HbHb液，按印于点样线上，点样处液，按印于点样线上，点样处离膜条边缘离膜条边缘1.5cm1.5cm左右左右。3 3）电泳：）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面向下，上样一端靠近负极，盖严电泳室。通向下，上样一端靠近负极，盖严电泳室。通电预电泳电预电泳5-10min5-10min。调节电压为。调节电压为100V100V，电泳，电泳30304040分钟。分钟。4 4）染色：）染色：电泳完毕后关闭电源。将膜条取下，电泳完毕后关闭电源。将膜条取下，放在丽春红染色液中染色放在丽春红染色液中染色1010分钟。分钟。5 5）漂洗：漂洗：取出染色膜条，放入漂洗液中漂洗取出染色膜条，放入漂洗液中漂洗至凝胶背景无色为止。至凝胶背景无色为止。五、结果与分析：五、结果与分析：（Results and Analysis Results and Analysis）观察膜条上观察膜条上HbHb条带的位置及颜色的深浅。条带的位置及颜色的深浅。绘图纪录之。绘图纪录之。Hb Hb醋酸纤维素薄膜碱性电泳可以筛选醋酸纤维素薄膜碱性电泳可以筛选异常异常血红蛋病血红蛋病。异常血红蛋白：指珠蛋白链中一个或数个氨 基酸被置换、缺失或增加，造成血红蛋白结构及功能异常，导致一系列病理和生理改变。是常见的遗传病之一是常见的遗传病之一.人类异常血红蛋白高达两千多种类型，约300人中即有一人是异常血红蛋白携带者。因此，在临床上快速、早期诊断尤为重要。分子病分子病 GeneGene突变导致蛋白质分子突变导致蛋白质分子质质和和量量异常，异常，从而引起机体功能障碍的一类疾病，称为从而引起机体功能障碍的一类疾病，称为分子病。分子病。异常异常HbHb病：病：1 1、基因突变导致珠蛋白结构改变。、基因突变导致珠蛋白结构改变。镰状细胞贫血镰状细胞贫血 2 2、基因突变导致珠蛋白肽链合成缺乏、基因突变导致珠蛋白肽链合成缺乏 或合成量异常。或合成量异常。地中海贫血：地中海贫血：、地贫地贫镰镰 状状 细细 胞胞 病病 形成原因形成原因：链第链第6 6位位谷氨酸谷氨酸被被缬氨酸缬氨酸取代，形成取代，形成HbSHbS（镰状（镰状H Hb)b)。在缺氧情况下，。在缺氧情况下，HbSHbS聚合形成长棒状聚合物，聚合形成长棒状聚合物，使红细胞镰变使红细胞镰变,变形能力低变形能力低，导致，导致溶血、贫血，溶血、贫血，引引起血粘度增高，起血粘度增高，血管梗阻性继发症状。血管梗阻性继发症状。发病的分子基础是：发病的分子基础是：链 基 因 的 一 个 碱 基 对链 基 因 的 一 个 碱 基 对 G A G(A)变 为变 为GTG(T)，致使血红蛋白的，致使血红蛋白的链链N端第端第6位的位的谷氨谷氨酸酸被被缬氨酸缬氨酸取代形成取代形成HbS。v临床症状临床症状：v血管阻塞的继发症状：一过性剧痛（腹痛、关节血管阻塞的继发症状：一过性剧痛（腹痛、关节痛）痛）,脑血管意外脑血管意外v急性大面积组织损伤：心梗，肺、肾脏损伤；急性大面积组织损伤：心梗，肺、肾脏损伤；v慢性溶血性贫血慢性溶血性贫血 患者多在成年以前死亡患者多在成年以前死亡 地中海贫血地中海贫血由于由于 珠蛋白基因的缺失或缺珠蛋白基因的缺失或缺 陷使陷使 链的合成受到抑制而引起的溶血性贫血。链的合成受到抑制而引起的溶血性贫血。特点：特点：b b 都表现为低色素性贫血都表现为低色素性贫血地中海贫血地中海贫血由于由于 珠蛋白基因的缺失或缺陷珠蛋白基因的缺失或缺陷使使 链的合成受到抑制而引起的溶血性贫血。链的合成受到抑制而引起的溶血性贫血。地中海贫血地中海贫血 最初发现在地中海地区居住的人群发病最初发现在地中海地区居住的人群发病率特别高，因而称为率特别高，因而称为地中海贫血。地中海贫血。实际上世界各地都有发生，非洲和东南实际上世界各地都有发生，非洲和东南亚也比较常见。我国东南沿海地区高发。亚也比较常见。我国东南沿海地区高发。血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的一、实验目的（Experimental Objectives）：）：1.1.掌握血清脂蛋白电泳的基本原理及操作方法掌握血清脂蛋白电泳的基本原理及操作方法2.2.了解血清脂蛋白测定的临床意义了解血清脂蛋白测定的临床意义 血清中的脂类物质均以不同的比例与载脂血清中的脂类物质均以不同的比例与载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白。各种脂蛋白中所蛋白结合成水溶性的脂蛋白。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，其颗粒大小相含载脂蛋白的种类及数量不同，其颗粒大小相差也很大。差也很大。1电泳分类法：电泳分类法：2超速离心法：超速离心法：乳糜微粒乳糜微粒 CM CM -脂蛋白脂蛋白 VLDLLDL 前前-脂蛋白脂蛋白 LDL LDL -脂蛋白脂蛋白 HDLHDL功能功能48508095507050转运外源性转运外源性三酰甘油和三酰甘油和胆固醇到全身胆固醇到全身转运内源性转运内源性三酰甘油到全身三酰甘油到全身转运内源性转运内源性胆固醇到全身胆固醇到全身逆向逆向转运转运胆固醇肝脏胆固醇肝脏分分 类类CMVLDL(Pre-LP)LDL(-LP)HDL(-LP)表表10-1 血浆脂蛋白的分类、组成、性质、功能血浆脂蛋白的分类、组成、性质、功能密度法密度法电泳法电泳法密度密度CMCMCMCM最小最小VLDLVLDL前前-脂蛋白脂蛋白LDLLDL-脂蛋白脂蛋白HDLHDL-脂蛋白脂蛋白最大最大组成组成特点特点含含TGTG最多最多 80958095；含含ApoApo最少；最少；含含TGTG第二多第二多 50705070含含ApoApo第二第二少少含含ChCh最多最多48504850含含ApoApo最多最多,5050 含含pLpL最多；最多；含含TGTG最少，最少，含含ChCh第二多。第二多。功能功能转运转运外外源性源性TGTG和和Ch Ch 由由肠肠 全身全身转运转运内内源性源性TGTG由由肝肝 全身全身转运转运内内源性源性ChCh由由肝肝 全身全身转转运外运外源性源性ChCh逆向转运逆向转运ChCh由由全身全身 肝肝合成合成部位部位小肠内膜上皮小肠内膜上皮细胞细胞肝细胞肝细胞血浆中血浆中VLDLVLDL转变而来转变而来肝细胞、小肠肝细胞、小肠粘膜细胞粘膜细胞二、实验原理二、实验原理(Experimental Principles)：在在pH 8.6pH 8.6的缓冲液中，脂蛋白带负电荷，的缓冲液中，脂蛋白带负电荷，在电场中向正极泳动。用琼脂糖凝胶作支持物在电场中向正极泳动。用琼脂糖凝胶作支持物进行电泳，各种脂蛋白因其所带的负电荷量及进行电泳，各种脂蛋白因其所带的负电荷量及颗粒大小、形状等不同，在电场中的泳动速度颗粒大小、形状等不同，在电场中的泳动速度也不一样，故可将其分离，用不同方法显色便也不一样，故可将其分离，用不同方法显色便可进行定性、定量分析。可进行定性、定量分析。三、主要设备、实验材料和试剂三、主要设备、实验材料和试剂 （Equipments,Materials and AgentsEquipments,Materials and Agents）（一）试剂（一）试剂 巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（PH8.6 I=0.05PH8.6 I=0.05）；制胶）；制胶缓冲液（缓冲液（PH8.6 I=0.05PH8.6 I=0.05）；）；0.45%0.45%琼脂琼脂糖凝胶；苏丹黑糖凝胶；苏丹黑B B染色液：制胶缓冲液染色液：制胶缓冲液（PH8.6 I=0.05PH8.6 I=0.05）（二）设备（二）设备 电泳仪和电泳槽；普通离心机；水浴箱；电泳仪和电泳槽；普通离心机；水浴箱；微量加样器等微量加样器等四、操作步骤四、操作步骤 （Operating Procedure）1 1预染血清：预染血清：取取Eppendof Eppendof 管一支，加入血清管一支，加入血清0.2ml0.2ml及苏丹黑及苏丹黑B B染料液染料液0.02ml0.02ml，混匀后，混匀后置于置于3737C C水浴中预染水浴中预染3030分钟，分钟，2000rpm2000rpm离心离心5 5分钟，取上清液备用。分钟，取上清液备用。2.2.制备琼脂糖胶板：制备琼脂糖胶板：将将0.45%0.45%的琼脂糖凝胶，经高温溶的琼脂糖凝胶，经高温溶化后，将胶模水平放置，插入上样梳。化后，将胶模水平放置，插入上样梳。待琼脂糖凝胶液冷却至待琼脂糖凝胶液冷却至6565左右时，左右时，小心倒入胶模中，使胶液缓慢、均匀小心倒入胶模中，使胶液缓慢、均匀展开，厚约展开，厚约0.5cm0.5cm，室温下静置，室温下静置30 min30 min，待凝固完全后，轻轻拔出上样梳，在待凝固完全后，轻轻拔出上样梳，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。胶板上即形成相互隔开的样品槽。3.3.点样点样：用微量加样器吸取预染血清约：用微量加样器吸取预染血清约15l15l，加入凝胶样品槽内。，加入凝胶样品槽内。4.4.电泳：电泳：加完样品后的凝胶板，立即通电。加完样品后的凝胶板，立即通电。点样端置于负极点样端置于负极。调电压。调电压100V100V，电泳约，电泳约4545分钟，观察到分开的电泳条带后关闭电源，分钟，观察到分开的电泳条带后关闭电源，取出凝胶板观察结果。取出凝胶板观察结果。五、结果与分析五、结果与分析 （Results and AnalysisResults and Analysis）肉眼观察各区带的颜色深浅、宽窄及其排肉眼观察各区带的颜色深浅、宽窄及其排列顺序，绘出脂蛋白电泳图谱。列顺序，绘出脂蛋白电泳图谱。正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从正正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从正极到负极依次为极到负极依次为-脂蛋白、前脂蛋白、前-脂蛋白脂蛋白和和-脂蛋白脂蛋白，原点处应为乳糜微粒。原点处应为乳糜微粒。CM电泳法电泳法 CM 前前 密度法密度法 CM LDL VLDL HDL对应关系对应关系*1.1.正常人血清脂蛋白琼脂糖电泳，可分离出三条正常人血清脂蛋白琼脂糖电泳，可分离出三条区带，从正极到负极依次为区带，从正极到负极依次为-脂蛋白、前脂蛋白、前-脂蛋白脂蛋白和和-脂蛋白，原点处应无乳糜微粒。且脂蛋白，原点处应无乳糜微粒。且-脂蛋白含量-脂蛋白含量前-脂蛋白。2.2.参考值：参考值：-脂蛋白（脂蛋白（LDL)LDL)：67%67%-脂蛋白脂蛋白(HDL)(HDL)：2030%2030%前前-脂蛋白脂蛋白(VLDL)(VLDL)：028.6%028.6%前-脂蛋白含量少时，在一般电泳谱上看不出来。正常人空腹血浆中虽有微量的乳糜微粒，但在一般电泳谱上也看不出来。血脂高于正常值上限即为高脂血症，可分为原发性和继发性两大类。原发性高脂血症原因不明，可能与遗传有关；继发性高脂血症是继发于其他疾病如糖尿病、肾病、甲状腺功能减退等。临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM 前 正常型a型b型型型型下次实验：下次实验：第三篇第三篇 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验第二十章第二十章 基础性实验基础性实验实验实验12 12 血糖测定血糖测定 P P146146实验实验1515 血清总胆固醇测定血清总胆固醇测定P P155155
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