第二十章蛋白质的复性

2021/3/111蛋白质的复性蛋白质的复性2021/3/112蛋白质的复性蛋白质的复性 为什么要进行蛋白质的复性？为什么要进行蛋白质的复性？外源基因导入外源基因导入E.coli等宿主细胞并表达蛋白质产等宿主细胞并表达蛋白质产物（物（）时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质的活性。所以要进行蛋白质的复性。的活性。所以要进行蛋白质的复性。1.什么是包涵体？什么是包涵体？2.为什么选择原核表达系统（特别是为什么选择原核表达系统（特别是 E.coli）？）？2021/3/113蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1142021/3/115蛋白质复性蛋白质复性2021/3/116蛋白质复性蛋白质复性2021/3/117蛋白质复性蛋白质复性2021/3/118蛋白质复性蛋白质复性2021/3/119蛋白质复性蛋白质复性大肠杆菌的重组菌 有多种可选择的质粒；有多种可选择的质粒；重组遗传背景清楚，基因表达易于控制；重组遗传背景清楚，基因表达易于控制；蛋白表达量高（可达总蛋白蛋白表达量高（可达总蛋白5050）；）；2021/3/1110蛋白质复性蛋白质复性2021/3/11112021/3/1112蛋白质复性蛋白质复性?分子伴侣是什么 参与协助新生肽链体内折叠的一类蛋白质，包括：核质素，热休克蛋白参与协助新生肽链体内折叠的一类蛋白质，包括：核质素，热休克蛋白6060家族（家族（Hsp60Hsp60），热休克蛋白），热休克蛋白7070家族（家族（Hsp70Hsp70），热休克蛋白），热休克蛋白9090家族家族（Hsp90Hsp90）和其他种类的分子伴侣）和其他种类的分子伴侣?分子伴侣对新生肽链折叠的促进作用 使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力；使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力；在肽链折叠过程中通过与折叠中间体上暴露的疏水区域结合而防止肽在肽链折叠过程中通过与折叠中间体上暴露的疏水区域结合而防止肽链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径?应用分子伴侣的策略 可采用表达外源基因的同时，共表达分子伴侣的策略。例如，可采用表达外源基因的同时，共表达分子伴侣的策略。例如，GroESGroES和和GroELGroEL可显著提高可显著提高D-D-核酮糖核酮糖-1-1，5-5-二磷酸加氧酶二磷酸加氧酶/羧化酶（羧化酶（rubiscorubisco）的折叠、）的折叠、组装效率，从而提高可溶性重组蛋白的产量；也能提高可溶性乙酰辅酶组装效率，从而提高可溶性重组蛋白的产量；也能提高可溶性乙酰辅酶A A脱脱氢酶的产量和组装效率；对可溶性氢酶的产量和组装效率；对可溶性-葡萄糖苷酶的表达也有提高葡萄糖苷酶的表达也有提高2021/3/1113蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1114蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1115蛋白质复性蛋白质复性2021/3/11162021/3/11172021/3/1118 蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1119蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1120蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1121蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1122蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1123蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1124蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1125蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1126蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1127蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1128蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1129蛋白质复性复性的影响因素 浓度 增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行 温度 蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（40）蛋白质的聚集将十分严重蛋白质的聚集将十分严重 pH值 通常复性在弱碱性条件下（通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免）进行，但要注意避免 与蛋白的与蛋白的pI值相近值相近 折叠促进剂 L-Arg,PEG,去污剂去污剂,尿素和盐酸胍尿素和盐酸胍2021/3/1130蛋白质复性蛋白质复性2021/3/11312021/3/11322021/3/1133蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1134蛋白质复性蛋白质复性红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与 蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度对复性的影响2021/3/1135蛋白质复性蛋白质复性 红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与蛋白质浓红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与蛋白质浓度对复性的影响度对复性的影响 图中有复性区、多聚体区和絮凝沉淀区。图中有复性区、多聚体区和絮凝沉淀区。降低盐酸胍浓度或增加蛋白质浓度都易使降低盐酸胍浓度或增加蛋白质浓度都易使系统进入多聚体区和絮凝区。要减少复性系统进入多聚体区和絮凝区。要减少复性的损失，就必须使操作处于复性界限之上。的损失，就必须使操作处于复性界限之上。2021/3/11362021/3/11372021/3/1138蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1139色谱法复性色谱复性方法原理复性蛋白凝胶色谱凝胶色谱（SEC）蛋白质蛋白质Stokes半径的半径的差异和凝胶排阻作用差异和凝胶排阻作用溶菌酶，牛碳酸酐酶，溶菌酶，牛碳酸酐酶，E.coli宿主整合因子，宿主整合因子，rhETS-1，RNase A，t-PA，Heterodimeric platelet-derived growth factor疏水色谱疏水色谱（HIC）蛋白质与介质的疏水蛋白质与介质的疏水性相互结合性相互结合rhIFN-，rhIFN-，重组人粒细胞集落刺激因子重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF离子交换色谱离子交换色谱（IEC）蛋白质与介质间存在蛋白质与介质间存在电荷作用力电荷作用力Papiloma virus(HPV)，E7MS2 fusion protein，重组白细胞分泌抑制因子重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白，抗原疫苗蛋白亲和色谱亲和色谱（AFC）蛋白与配体的特异性蛋白与配体的特异性亲和吸附亲和吸附重组人朊病毒重组人朊病毒rhPrion，牛碳酸酐酶，牛碳酸酐酶，IgG2021/3/1140蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1141蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1142蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1143蛋白质复性蛋白质复性2021/3/1144各种重组蛋白质复性方法的比较各种重组蛋白质复性方法的比较复性方法复性率蛋白浓度过程集成性成本传统方法(稀释、透析、超滤)蛋白浓度低时高蛋白浓度高时低低无低改进后传统方法（温度跳跃、分批进料、连续进料）较高较高无较低新方法抗体法高高无高分子伴侣法高高无高人造分子伴侣法高高无较低反向微团法高低无较低双水相法不明不明将包涵体的溶解与蛋白的复性过程集成较低色谱法高高将蛋白的复性与纯化过程集成较低2021/3/1145蛋白质复性蛋白质复性复性效果的检测与评价复性效果的检测与评价1.凝胶电泳凝胶电泳2.光谱学方法光谱学方法3.色谱学方法色谱学方法4.黏度与浊度黏度与浊度5.免疫学方法免疫学方法6.生物学活性及比活性测定生物学活性及比活性测定