厦门大学生物化学实验讲义

生物化学实验 厦门大学环境与生态学院 2016.2 i 目 录 实验室守则.1 实验记录及实验报告.2 实验一 淀粉的提取和水解.4 实验二 总糖与还原糖的测定.6 实验三 粗纤维的测定.9 实验四 酪蛋白的制备.12 实验五 粗脂肪的定量测定索氏提取法.14 实验六 蛋白质等电点测定.16 实验七 氨基酸的分离鉴定纸层析法.18 实验八 蛋白质含量的测定.21 实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳.34 实验十 影响酶活性的因素.41 实验十一 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定.45 实验十二 凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶.51 实验十三 DEAE-纤维素柱层析纯化碱性磷酸酶.51 实验十四 底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定）.56 实验十五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白.61 实验十六 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点.69 实验十七 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量.74 实验十八 维生素 C 的定量测定.79 实验十九 猪脾 DNA 的制备.84 实验二十 DNA 的定量测定.87 实验二十一 DNA 的琼脂糖凝胶电泳.89 实验二十二 RNA 的定量测定.92 实验二十三 肌糖原的酵解作用.94 实验二十四 茶叶多糖的提纯与鉴定.97 仪器的使用.99 附录.101 1 实 验 室 守 则 1、遵守课堂纪律，认真进行实验 每个学员应该自觉地遵守课堂纪律，维护课堂秩序，保持室内安静，不大声谈笑。实验过程中要听从教师指导，严格认真地按操作规程进行实验。并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上，完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室、实验后要认真写好实验报告，由课代表按期收交给教师，不无故拖延。2、保持整洁 保持环境和仪器的整齐清洁是做好实验的重要条件，也是每个实验者必须养成的良好的工作习惯。实验台面和试剂药品架上都必须保持整洁，仪器药品放置要有次序，不要把试剂、药品洒在实验台面和地上，废液应倒进水槽内（强酸强碱必须都应倒入废品缸内，不可倒入水槽或随地乱扔。实验完毕需将仪器洗净收好，药品试剂排列整齐。注意保持实验台面干净及实验室整齐清洁。3、药品使用 使用药品试剂必须注意节约杜绝浪费，要特别注意保持药品和试剂的纯净，药品用后须立即将瓶盖塞紧放回原处，从瓶中取出的试剂，标准溶液等，如未用尽切勿倒回瓶内，避免混杂。4、仪器使用 各种仪器用具均应注意爱护，细心使用，防止损坏，使用电子天平，分光光度计和离心机等贵重精密仪器，要严格遵守操作规程，发现故障立即报告教师，不要自己动手检修，要爱护国家财产，厉行节约。5、注意安全 为了有效地维护实验室安全，保证实验正常进行，要求：1）要严格做到：火着人在，人走火灭；2）勿使乙醚、丙酮、醇类等易燃液体接近火焰，蒸发或加热此类液体时，必须在水浴上进行，切勿用直火加热；3）凡比水轻且不与水相混溶之物（如醚、苯、汽油等）着火时，应迅速用湿毛巾覆盖火焰，以隔绝空气使其熄灭，绝不能倒水于其上，以免火焰蔓延，对于易与水混溶之物（如乙醇、丙酮等）着火时，可用火扑灭之；4）有不少药品是有毒或有腐蚀性的不可用手直接拿药品，不可将试剂瓶直接对准鼻子闻，更不可尝药品味道。用移液管吸取有毒试剂，强酸和强碱时，均应用洗耳球，严禁用口吸取；5）离开实验室时，要关好水龙头，拉下电闸，认真负责地进行检查，严防不安全事故；6）每次实验课由班长安排同学轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性工作。2 实验记录及实验报告 一、实验记录 实验课前应认真预习，将实验名称、目的和要求、原理、实验内容、操作方法和步骤等简单扼要地写在预习报告中。实验中观察到的现象、结果和数据，应该及时地直接记在预习报告中，绝对不可以用单片纸做记录或草稿。实验记录不要抹擦及涂改，写错时可以准确地划去重写，记录时必须使用钢笔或圆珠笔。原始记录必须准确、简炼、详尽、清楚，从实验课开始就应养成这种良好的习惯。记录时，应做到正确记录实验结果，切忌夹杂主观因素，这是十分重要的。在实验条件下观察到的现象，应如实仔细地记录下来；在定量实验中观测的数据，如称量物的重量，滴定管的读数，分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如，光密度值为 0.050，不应写成 0.05。实验记录上的每一个数字，都是反映每一次的测量结果，所以，重复观测时即使数据完全相同也应如实记录下来。总之，实验的每个结果都应正确无遗漏地做好记录。实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量准确的浓度等，都应记录清楚，以便总结实验进行校对和作为查找成败原因的参考依据。如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，在获得老师允许后，应当重做实验。因为，将不可靠的结果当做正确的记录，在实际工作中可能造成难以估计的损失，所以，在学习期间就应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。二、实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告按照实验内容可分为定性和定量实验两大类，下面分别列举这两类实验报告的格式，仅供参考。l、关于定性实验报告 实验（编号）（实验名称）（一）目的和要求 （二）原理 （三）试剂和仪器 （四）操作方法 （五）结果与讨论 一般每次实验课做数个定性实验，实验报告中的实验名称和目的要求应该是针对这次实验课的全部内容而必须达到的目的和要求。在写实验报告时，可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法（或步骤）可以采用工艺流程图的方式或自行设计的表格来表示（某些实验的操作方法可以和结果与讨论部分合并，自行设计各种表格综合书写）。3 结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题（和思考题）进行探讨以及对实验的改进意见等。2、关于定量实验报告 实验（编号）（实验名称）（一）目的和要求 （二）原理 （三）试剂和仪器 （四）操作方法 （五）结果处理 （六）讨论 通常每次实验课只做一个定量实验，在实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂及仪器）和操作的关键环节必须写清楚，对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图（以及比较实验组与对照组实验结果的图表）等。（另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析）。讨论部分可以包括：关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象（以及思考题）进行探讨，对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。4 实验一 淀粉的提取和水解 一、目的要求 掌握淀粉提取和水解的原理及操作方法。二、原理 多糖是自然界分布最广的糖类，由多个单糖分子缩合而成，具有多种生物学功能，如植物纤维素可构成植物的骨架，而淀粉、糖原则作为营养的存储形式。本实验以地瓜为原料，利用多糖能和水形成胶体溶液的原理，采用过滤、离心等方法提取淀粉。糖苷键对酸和酶敏感，所以淀粉在酸和体内淀粉酶的作用下被降解成单糖，这种降解过程是逐步进行的，降解的中间产物遇碘曾现不同的颜色：淀粉 红色糊精 无色糊精 麦芽糖 葡萄糖 所以根据水解液和碘反应的颜色，可以判断水解是否已完全。本实验中采用酸水解的方法，用过量的酸保证水解完全。三、试剂与器材 试剂：6 mol/L 盐酸、6 mol/L 氢氧化钠 器材：高速组织捣碎机、恒温水浴锅、电磁炉 四、操作方法（1）淀粉的提取 甘薯去皮切成小块（约 0.30.30.3cm3），准确称取 15g，加入 60mL 蒸馏水，放入组织捣碎机中捣碎 1min（以上步骤可以 4 组合作）。匀浆液用三层纱布过滤，滤渣用少量水洗，滤液合并后置 50oC 恒温水浴中保温 30min。轻轻地尽量倾去上层有色溶液，用 25 mL 蒸馏水重新悬浮白色沉淀，待重新沉淀后再倾去上层溶液，滤纸过滤或用离心机离心（3000 r/m，10 min），再用少量水洗沉淀，3000 r/m 离心 10 min，连滤纸移至培养皿中置烘箱内烘干（105烘干 4h）后称重。（2）淀粉的水解 称取淀粉 1.0 g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入 15 mL 水和 6 mol/L 盐酸 10 mL，搅拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用 6 mol/L 氢氧化钠中和至溶液呈中性，然后定容至 100 mL，再取 10 mL 定容到 100 mL 成为稀释 1000 倍的总糖水解液。五、注意事项（1）淀粉提取时水浴温度不能超过 50，否则会因淀粉溶解度增大而减少产量；（紫蓝色）（红色）（无色）5 （2）倾出上清时要尽可能小心，避免沉降的淀粉被震动起来。（3）离心机使用时要注意先进行离心管的平衡。六、思考题 （1）如何选择生化物质实验中的实验材料？有何标准？（2）材料的破碎方法有哪些？6 实验二 总糖与还原糖的测定 一、目的要求 掌握碱性铜试剂法测定还原糖的原理和操作方法。二、原理 单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。还原糖的测定方法多种，本实验采用间接滴定法。其原理是：在碱性溶液中，二价铜离子被还原糖还原成一价的氧化亚铜，氧化亚铜在酸性环境中与一定量的过量碘起反应，再用标准硫代硫酸钠滴定剩余的碘，即可算出还原糖的含量。反应方程式是：三、试剂与器材 1.试剂（1）铜试剂：7（A）13 g 硫酸铜加水至 1000 mL(B)24 g 酒石酸钾钠（用以保持铜离子碱性液中不生成 Cu(OH)2沉淀）；40 g 无水碳酸钠 50 g 碳酸氢钠 36 g 草酸钾（用以抑制铜离子的还原）1.6 g 碘酸钾（用以从碘化钾溶液中释放出一定量的自由碘）制备溶液 B 时，先用 500 mL 热水溶化、，再加、，然后加水至 1000 mL，最后将（A）、（B）等量混合。（2）0.005 mol/L 硫代硫酸钠：1.24 g 硫代硫酸钠和 0.1 g 碳酸钠加水配成 1000 mL。（3）1%淀粉：1 g 可溶性淀粉溶于 100 mL 饱和的 NaCl 溶液中煮沸。（4）2%碘化钾：20 g KI 用水溶至 1000 mL。（5）2 mol/L 硫酸：166.6 mL 母液溶于水至 1500 mL。（6）0.5 mg/mL 标准葡萄糖：0.5 g 葡萄糖加水至 1000 mL。2.器材 碱式滴定管、电磁炉 四、操作步骤（1）样品中总糖的水解：称取淀粉 1.0 g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入 15 mL 水和 6 mol/L 盐酸 10 mL，搅拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用 6 mol/L 氢氧化钠中和至溶液呈中性，然后定容至 100 mL，再取 10 mL 定容到 100 mL 成为稀释 1000 倍的总糖水解液。（2）取 6 只试管，按照下表的次序加入试剂。另取 6 个小三角烧瓶，按相应的试管顺序编号。试剂 管号 H2O(mL)标准葡萄糖（mL）总糖水解液（mL）铜试剂（mL）沸 水 浴 中 煮 沸 15 分 钟 空 白 试 验 1 2 4 2 2 4 标 准 试 验 1 1 1 4 2 1 1 4 总 糖 试验 1 2 4 2 2 4 （3）各试管冷却后，摇动试管，使试管底部的红色沉淀分散后倾入相应的三角瓶中；用以保持一定的碱性环境环境 8（4）分别在每个试管中加入 2 mL 2碘化钾溶液和 2 mL 2 mol/L H2SO4，以洗涤管中的残留物，并转入相应的三角瓶中，最后再用蒸馏水洗涤试管 2 次，每次 1mL，洗涤液均转入相同的三角瓶中；（5）用 0.005 mol/L NaS2O3滴定至碘颜色接近消失时加入淀粉指示剂 5 滴，继续滴定至蓝色消失为止。五、计算 按照如下公式计算还原糖的含量：（V空V标）/0.5 mg（V空V未知）/X（X 为样品中还原糖的含量）（未知空标空V-VV-5.0VX 六、注意事项（1）各试管的处理应一致，测定溶液应同时放入沸水中，再同时从沸水浴中取出。（2）在用碘化钾和硫酸洗涤试管时要洗净，否则会影响滴定结果的准确性。（3）滴定终点时碘与淀粉反应形成的紫蓝色褪尽，溶液呈现二价铜离子的浅天蓝色，不要误以为终点未到。七、思考题(1)碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优点？9 实验三 粗纤维的测定 一、目的要求 学习和掌握粗纤维的定量测定方法。二、原理 粗纤维是指不能被稀酸、稀碱所溶解，不能被人体或家畜所消化利用的天然有机物质。其主要成分为纤维素、残存的半纤维素和木质素。本法是在热的稀酸处理下，样品中的淀粉，果胶质和部分纤维素被水解出去后，再用热的氢氧化钠处理，溶解除去蛋白质、部分半纤维素和部分木质素，并使脂肪皂化而去除。然后用乙醇或乙醚处理除去单宁、色素、残余脂肪、蜡、部分蛋白质和戊糖，所得的残渣，扣除灰分（金属氧化物），即为粗纤维。三、试剂与器材 1.试剂：1.25%硫酸、1.25氢氧化钠、正辛醇、95乙醇 2.器材：干燥箱、粗纤维测定仪 四、操作方法 1.操作前的准备(1)将仪器放置于工作台上，工作台就近应有水池和水嘴。将三个烧瓶放置于仪器顶部的电加热板上，并将顶部小孔中伸出的写明酸、碱、蒸馏水的橡胶管套在相应的烧瓶底部的水嘴上。三个烧瓶的位置从左至右相应为酸、碱、蒸馏水。然后将进出水嘴（位于机箱左下侧）分别套上橡胶管，5 个水嘴分别为：靠前的两个为进水嘴，靠后的上面两个为出水嘴，靠后的下面一个为抽滤出水嘴，应用橡胶管引入水池。(2)将样品用粉碎机粉碎，全部通过 18 目筛后，放入密闭容器。(3)样品中若脂肪含量大于 10，则必须脱脂，脂肪含量若小于 10可不脱脂。(4)将坩锅用蒸馏水洗尽，使其不带任何杂质，并将其置于恒温箱内（温度在 100oC 左右）烘 30 分钟左右然后移入干燥器内冷却至室温，并将其编号，再置于干燥器内备用。(5)将电源线一头插入仪器右下侧的电源插座中，另一头插入交流 220V 的电源插座中，实验室的电源插座必须用三脚插座，且必须有可靠接地。(6)在仪器顶部的酸、碱、蒸馏水烧瓶中分别加入已配制好的酸、碱、蒸馏水，应基本加满。将瓶盖盖上。(7)在坩锅内放入 l-2 g 试样，并将装好试样的坩锅分别放入 6 个抽滤座中，注意应放置于抽滤座中央的硅橡胶圈上，并使其与上面的消煮管下套中的硅橡胶口对齐，不要将坩锅放偏或放斜，否则将10 会漏液，当六个坩锅均放置准确后稍压下操纵杆柄并锁紧。(8)打开进水开关。将面板上预热调压旋钮和消煮调压旋钮逆时针旋到底，打开电源开关，调整定时器的设定时间为 30 min，以后使用时可不必调节。(9)开启酸、碱、蒸馏水预热开关，调节预热调压旋钮，将其调到顺时针最大，这时左边电压表显示电压为 220V 左右。(10)等酸、碱、蒸馏水沸腾时，将预热电压调小至酸、碱、蒸馏水微沸。(11)打开加酸开关，分别按 l-6 号加液按钮在消煮管中加入已沸的酸液 200 mL 约到消煮管中间刻度线，再在每个消煮管内加 2 mL 正辛醇。关闭酸预热开关，开启消煮加热开关将消煮调压旋钮调至最大，此时右边电压表显示约 220 V 左右，待消煮管内酸液再次沸腾后再将电压调至 150-170 V 左右，使酸液保持微沸，向上打开消煮定时开关，保持酸微沸 30 min。(12)将消煮加热开关关闭，将消煮定时开关向下关闭，将消煮调压旋钮逆时针旋到底，打开 l-6 号抽滤开关，打开抽滤泵开关，将酸液抽掉。抽完酸液后，先关闭抽滤泵开关，再关闭抽滤开关。打开蒸馏水开关，再按下 l-6 号加液按钮，在消煮管中加入蒸馏水后再抽干，连续 2-3 次，直至用试纸测试显中性后关闭加蒸馏水开关。在抽滤过程中若发现坩锅堵塞时，可关闭抽滤泵，开启反冲泵用气流反冲，直至出现气泡后关闭反冲泵，打开抽滤泵继续抽滤。洗涤完毕后关闭所有抽滤开关及泵开关。(13)打开加碱开关，分别在消煮管中加入微沸的碱溶液 200 mL 后关闭加碱开关，再在每个消煮管中加入 2 滴正辛醇后重复第 11 后半部分和第 12 步的操作，进行碱消煮、抽滤和洗涤。(14)以上工作完成以后，用吸管分别在消煮管上口加入 25 mL 左右 95乙醇，浸泡十几秒钟后抽干。(15)将操纵杆手柄稍用力下压后拉出定位装置，使升降架缓慢上升复位，戴上手套后将坩锅取出，移入恒温箱，在 130oC 下烘干 2 小时，取出后在干燥器中冷却至室温，称重后得到试样质量 m。(16)将称重后的坩锅再放入 500oC 的高温炉内灼烧 1 小时，取出后置于于燥器中冷却至室温后称重后得到 m。测定结果按下式计算：%mm-m%21粗纤维 式中：m1100oC 烘于后坩锅及试样残渣重；m2500oC 灼烧后坩锅及试样残渣重；m试样（未脱脂）质量。11 图 1 粗纤维测定仪 五、注意事项(1)样品粒度的大小将影响分析结果，通常将样品研磨成粒度为 1mm3左右为宜。(2)样品脂肪含量大于 10%，应先脱脂，脱脂不足，则分析结果偏高。六、思考题(1)在本测定中哪些因素是影响测定结果的主要因素？(2)在测定中为什么必须严格控制实验条件?(3)用本方法测定的结果为什么称为“粗纤维”？蒸馏水烧瓶 12 实验四 酪蛋白的制备 一、目的要求 1、掌握从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。2、了解等电点沉淀在蛋白质制备中的应用。二、原理 牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成份。蛋白质中的酪蛋白通过等电点沉淀，再通过离心而获得，糖类小分子由于处于清液中而分离，沉淀物中所含的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白色、晶状酪蛋白。三、试剂与器材 材料：牛奶（奶粉配制，3）试剂：0.2 mol/L HAc-NaAc 缓冲液、95%乙醇、乙醚 器材：离心机、水浴锅、pH 计 四、操作方法 1.取 10 mL40C 牛奶预热，加入 40C 预热的醋酸缓冲液 10 mL 左右，边加边搅拌，调 pH 至4.7，室温冷却，5000 r/min 离心 5min，得到沉淀。2.沉淀于离心管内加入 4 mL H2O 悬浮，5000 r/min 离心 5min，得到沉淀。3.沉淀于离心管内加入 20 mL 乙醇，放置 5min，微搅动，去脂肪。4.漏斗过滤(或 5000 r/min 离心 5min)上述悬浮液，在漏斗中加入 20 mL 乙醇悬浮沉淀，滤干(或5000r/min 离心 5min)。5.加入 20 mL 乙醇乙醚混合液（1:1）洗涤，漏斗过滤(或 5000 r/min 离心 5min)，后再加入 20mL乙醚洗涤脂肪完毕，漏斗过滤。6.于 60C，带滤纸烘干 4h，称重并计算得率。五、计算 六、注意事项 1、牛奶与缓冲液要预热。2、缓冲液要缓加缓搅。酪蛋白质量（g）10 mL 牛奶 实际获得百分率 100 13 3、在滤纸上样品的脱脂过程要搅动，不得破损滤纸。4、实验环境要保持空气流通，门窗要开。七、思考题(1)在酪蛋白制备时为什么要用醋酸缓冲液调 pH 到 4.8？(2)乙醚、乙醇作用是什么？14 实验五 粗脂肪的定量测定索氏提取法 一、目的要求 学习和掌握粗脂肪的定量测定法索氏提取法 二、原理 脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物，能溶于脂溶性有机溶剂。本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30C-60 C 的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。三、材料、试剂与器材 材料：全脂奶粉 试剂：乙醚 器材：粗脂肪测定仪、干燥箱 四、操作方法 1.操作前准备：抽提筒用蒸馏水洗净，置干燥箱在 105 温度下烘 1 小时，取出移入干燥缸内，冷却后称重编号备用。2.样品准备：样品磨碎，称取约 1.0g 在 105 温度下烘 30 分钟，趁热倒入研钵中，加入约 2g 脱脂细砂一同研磨。将试样和细砂研到出油状后，全部置入滤纸筒内（筒底塞一层脱脂棉，并在 105 温度下烘 30 分钟），用脱脂棉蘸少量乙醚揩净研体上的试样和脂肪，并入滤纸筒内，最后再用脱脂棉塞入上部，压住试样。3.移动滑动球，把滤纸筒置入抽提筒内，使磁钢把过滤筒吸住，并观察滤纸筒是否在抽提筒上口对准下压紧圈的园柱孔，两者平面保持良好接触。4在抽提筒内注入无水乙醚约 50ml，然后将抽提筒移置加热板上，调节位置使抽提筒上口对准下压紧圈的圆柱孔，两者平面保持良好接触。5.开启电源，根据所需加热温度调节电加热旋钮到 60，显示屏上直接显示加热温度值。移动滑动球（上滑）使试样置入抽提筒内（此时）滤纸筒底与抽提筒底接触，做到不使滤纸筒脱落，使试样完全浸入溶剂内浸泡）。6.从溶剂挥发开始浸泡约 0.5 h，然后将纸筒升高 5 cm 进行抽提，约 1 h 后再将滤纸筒提升 1cm（最高位置），同时将冷凝管调旋塞完全关闭（即旋塞于柄位置与水平面平行），进行溶剂回收。7.将抽提筒从加热板上取出，置入恒温箱内，烘去水份，然后移入干燥缸内冷却后称重，计算含油15 量。8.使用完毕关闭电源，并保持机内干净。五、结果处理 根据下表将实验结果分别填入并计算样品的粗脂肪百分含量：样品重量（g）抽提桶重（g）抽提桶及脂肪重（g）脂肪重（g）粗脂肪含量（）六、注意事项 乙醚为易燃有机溶剂，实验室应保持通风并禁止任何明火。七、思考题（1）本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？（2）本实验样品制备时烘干为什么要避免过热?16 实验六 蛋白质等电点测定 一、目的 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。二、原理 蛋白质的分子量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符号的电荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。蛋白质分子所带的电荷与溶液的 pH 值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子。蛋白质分子所带净电荷为零时的 pH 值称为蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明显。各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是 4.74.8，血红蛋白等电点为6.76.8，胰岛素是 5.35.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH 12.012.4。近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。本实验采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的 pH 值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。三、器材及试剂 1器材：试管、吸管、移液管、量筒、500mL 容量瓶、试管架 2试剂：（1）0.01 mol/L 醋酸溶液 （2）0.1 mol/L 醋酸溶液（3）1 mol/L 醋酸溶液（4）1 mol/L 氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）（5）酪蛋白 四、操作步骤 1制备蛋白质胶液（1）称取酪蛋白 3 克，放在烧杯中，加入 50 mL 40的蒸馏水。（2）加入 50 毫升 1 mol/L 氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。（3）在烧杯中再加入 1 mol/L 醋酸溶液 50 mL，摇匀，使蛋白质完全溶解为止。17（4）将溶解好的蛋白溶液转移到 500 mL 容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。加入蒸馏水定容至 500 mL，得到略现浑浊的、在 0.1 mol/L NaAC 溶液中的酪蛋白胶体。2等电点测定 2等电点测定 按下表顺序准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，混匀后，在各管中加入蛋白质胶液并立即摇匀。管号 H2O(mL)0.01 mol/L HAC(mL)0.1 mol/L HAC（mL）1 mol/L HAC（mL）pH 蛋白质 胶液(mL)观 察 0 分钟 10 分钟 20 分钟 1 4.38 0.62 5.8 1 2 3.75 1.25 5.5 1 3 4.75 0.25 5.2 1 4 4.50 0.50 4.9 1 5 4.00 1.00 4.6 1 6 3.00 2.00 4.3 1 7 1.00 4.00 4.0 1 8 4.20 0.80 3.7 1 9 3.40 1.60 3.4 1 观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+，+，+，表示浑浊度。五、思考题（1）在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。（2）在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？18 实验七 氨基酸的分离鉴定纸层析法 一、目的 通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理 层析法又称色谱法。1903 年，科学家发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用 表示分配系数。=LSCC溶质在流动相的浓度溶质在固定相的浓度 一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的 OH 基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘 2 厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶剂系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转 90，再用另一个溶剂系统展层。物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用 Rf表示。Rf=原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距 若 X 表示原点到层析点中心的距离。X+Y 表示原点到溶剂前沿的距离，则 R f=YXX R f值的主要决定因素是分配系数（）。对于某一物质在一定条件下的 值是固定的。因此 R f19 值为其特征常数。现将影响 R f值的因素概括如下：1、物质结构的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此 R f低于后者。CH2基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则CH2基增加，整个分子的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值亦随之增加，例如氨基酸的 R f值：甘氨酸丙氨酸亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸谷氨酸。极性基团的位置不同也会引起 Rf变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，-丙氨酸的 R f值大于-丙氨酸。2、溶剂的影响：同一物质在不同溶剂中 R f值不同，选择溶剂系统时应使被分离物质在适当 Rf值范围内（0.005 到 0.85 之间），并且不同物质的 R f至少差别为 0.05 才能彼此分开。溶剂的极性大小也影响物质的 Rf值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的 Rf值随着溶剂碳原子数目增加而降低。3、pH 的影响：溶剂系统的 pH 会影响物质极性基团的解离形式，如对于酸性氨基酸，在酸性时所带净电荷比碱性时少，带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中 Rf值较碱大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。溶剂的 pH 还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于极性物质如氨基酸来说 Rf值增加，非极性物质则减少。若 pH 不适合，使同种物质有不同解离形式，其 Rf也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中含有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸（0.01 mol/L-1或 0.4 mol/L-1HCl）洗涤滤纸将之除去。5、温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对 Rf值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过0.5。除上述因素影响 Rf值外，样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作显色剂。茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的20 显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。三、器材及试剂 1器材 层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、电吹风、层析滤纸（新华一号）2试剂(1)展开剂：溶剂系统（24 mL）：正丁醇乙酸水（4：1：3，V/V)(2)氨基酸溶液：0.5%的脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为 0.5%）。(3)显色剂：0.1%水合茚三酮乙醇溶液。0.5%四、操作步骤 1将配好的层析液倒入培养皿中，把培养皿放入层析缸中，盖紧缸盖，放置 30 分钟。2取层析滤纸（长 1820 厘米，宽 14 厘米）一张。在垂直于纸的纹路一端距边缘 1.5 厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔 2 厘米作一记号，作为点样位置（共 6 点），并用铅笔在点样点下端写出所点氨基酸的名称。3点样：用毛细管吸取样品约 2cm 高，将各氨基酸样品分别点在这六个位置上，用电吹风吹干后再点一次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大不超过 5 毫米。4扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线 1 厘米。当前沿线到达层析纸 2/3-3/4 处时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，用电吹风热风吹干。5显色：用喷雾器均匀喷上 0.1%茚三酮溶液，然后用热风吹干即可显出各层析斑点。6用铅笔画出层析斑点并算出 Rf值。五、注意事项 1.为了防止滤纸被手上的汗液污染，在操作时带手套。2.重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸。六、思考题（1）如何用纸层析法对氨基酸进行定性和定量的测定？（2）纸层析和柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？（3）请对试验中所用的几种氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。21 实验八 蛋白质含量的测定 目的要求 1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2.掌握测定蛋白质浓度的操作技术 （一）微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量 一、原理 天然有机物(如蛋白质和氨基酸等化合物)的总氮量通常用微量凯氏定氮法(Micro-Kjeldahl Method)来测定。当被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为消化。由于消化过程进行缓慢，实验中常添加硫酸钾和硫酸铜的混合物来促进，硫酸铜是催化剂，硫酸钾可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。上述过程的化学反应如下：(1)消化 有机氮化物(C、H、O、N、P、S)+浓 H2SO4CO2+H2O+NH3+SO2+H3PO4 NH3+H2SO4(NH4)2SO4(2)蒸馏(NH4)2SO4+NaOHNa2SO4+H2O+NH3(3)吸收 NH3+H3BO3NH4HB4O7+H2O(4)滴定 NH4HB4O7+HClNH4Cl+H3BO3 在微量凯氏定氮法中，常用硼酸-指示剂混合液收集氨，氨与溶液中氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度，即指示剂变回原来颜色为止。所用无机酸的摩尔数即相当于样品中氨的摩尔数。本法适用范围约为 0.2-1 mg 氨。因为蛋白质含氮量通常在 16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数 6.25，便得到该样品的蛋白质含量。22 二、试剂和器材 1.试剂(1)浓硫酸（AR），(2)粉末硫酸钾-硫酸铜混合物：K2SO4CuSO45H2O=31、61 或 101，(3)40%（W/V)氢氧化钠溶液，(4)4%（W/V)硼酸溶液，(5)0.01 mol/L 标准盐酸（用硼砂标定)：吸取分析纯盐酸（比重 1.19，约 12 mol/L)8.5 mL，用蒸馏水稀释至 1 L，贮于试剂瓶中待标定。准确称取 3 份干燥的硼砂，每份 0.381-0.383 g 分别放在 150 mL三角瓶中，加入 20 mL 蒸馏水使其溶解，加入三滴甲基红指示剂（0.1 g 甲基红溶于 250 mL 水中），用待测的盐酸滴定至橙红色为止，记下盐酸的滴定体积，通过计算即可知道盐酸的准确浓度：CHCl=VMWr1000 式中，W 为硼砂称量（g)；V 为 HCl 的滴定体积（mL)；Mr为硼砂分子量。(6)混合指示剂贮备液：取 50 mL 0.1%甲烯蓝乙醇溶液与 200 mL 0.1%甲基红乙醇溶液混合而成，贮于棕色瓶中备用。此指示剂在 pH 5.2 为紫红色；pH 5.4 为暗蓝色（或灰色）；pH 5.6 为绿色。变色范围很窄，变色点 pH 为 5.4，故混合指示剂很灵敏。(7)标准硫酸铵溶液（0.3 mg 氮/mL)：取 141.6 mg 分析纯硫酸铵，加水溶解，定容至 100 mL。2.待测样品：豆浆(市售)3.器材(1)微量凯氏定氮仪，(2)50 mL 凯氏烧瓶，100 mL 锥型瓶，50 mL 酸式滴定管，100 mL 量筒，100 mL 容量瓶，100 mL烧杯，酒精灯 三、操作方法 3.1 样品的消化 在凯氏烧瓶中加入催化剂约 50 mg，用移液管依次加入 3 mL 均一的豆浆和 3 mL 浓硫酸（移液管要接近凯氏烧瓶底部，不使样品粘附在瓶口或瓶颈）。另取一支凯氏烧瓶加入 3 mL 水代替豆浆，其余试剂同上，此为空白。将凯氏烧瓶放在通风柜内的电炉上加热，火力不要太猛，应以使液体保持微沸状态为宜。瓶内液体逐渐由黄色变为黑色，继而转为淡黄色，最后成清澈淡蓝色溶液，消化即告完全，取出烧瓶，冷却，将瓶内液体转移至 50 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。3.2 仪器的装置和蒸洗 按图 2 装好凯氏定氮仪，再用蒸气进行蒸洗，以除去 NH3和其它干扰物质。蒸洗方法如下：接通冷凝水，打开夹子（J），往蒸馏瓶（B）内加入占球部 1/3 体积的清水，而后取 5 mL 蒸馏23 水从小漏斗（A）缓慢地注入反应瓶（F），关上夹子（I），同时加热蒸馏瓶（B），蒸馏反应瓶内的蒸馏水，使其沸腾产生蒸气。产生的气体沿导管上升到冷凝管（C），气体经过冷却从冷凝管末端（G）流入收集瓶。排出反应瓶（F）中的液体，重复蒸洗 23 次，以便较熟练掌握蒸洗的方法。（反应瓶（F）中的液体排出的方法：样品蒸馏完毕后，继续加热使其沸腾，移开酒精灯，关上夹子（I），稍等片刻，由于蒸馏瓶（B）中的蒸气较反应瓶（F）中的多，所以冷却后蒸馏瓶（B）中的压力比反应瓶（F）的低，反应瓶（F）内的废液迅速地从出样口（H）抽出到反应瓶外，随即自加样小漏斗（A）往反应瓶（F）中较快地倒入一些冷蒸馏水，关上夹子（I），稍等片刻，反应瓶（F）内的液体又迅速地从出样口（H）抽出，然后打开夹子（K）排出蒸馏瓶中的热水，关上夹子（K），打开夹子（J），往蒸馏瓶（B）中加入 1/3 球部体积的清水，即可进行下一次蒸馏）。仪器的安装和蒸洗过程中，应很好地掌握几个夹子的开关关系，避免漏气是实验成败的关键步骤。3.3 标准硫酸铵的测定(1)吸取 10 mL 4%硼酸溶液注入三角烧瓶，加入 2 滴指示剂，将其倾斜地放在冷凝管末端（G）下，使管末端插入溶液内。(2)用移液管准确吸取 5 mL 标准硫酸铵溶液置于小漏斗（A），小心打开夹子（I），使其缓慢流入反应瓶（H），用 12 mL 蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶（H）。(3)量取 5 mL 40%NaOH 溶液，置小漏斗（A），小心打开夹子，使其缓慢流入反应瓶（H），同样用图 2 微量凯氏定氮仪装置图 A小漏斗 B蒸馏瓶 C冷凝管 D入水口 E出水口 F反应瓶 G冷凝管末端 H出样口 I、J、K.夹子 24 12 mL 蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶（H），关上夹子（I），避免蒸馏过程中氨散失。(4)加热蒸馏瓶（B）使反应瓶内液体开始沸腾，立即收集氨，当三角瓶中溶液由紫红色变成鲜绿色开始记时，蒸馏 5 min 后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约 1 cm，继续收集 2-3 min，最后用蒸馏水把末端剩余的氨全部洗到三角瓶中，即算蒸馏完毕。排出废液，量取 5 mL 蒸馏水蒸洗反应瓶一次，就可以进行第二份标准硫酸铵溶液的蒸馏工作。(5)将收集的各瓶蒸馏液分别用 0.0100 mol/L 标准盐酸溶液滴定至蓝色消失，使溶液呈淡桔红色为止。用标准硫酸铵溶液连续测定三次，三次测定的终点颜色应一致，滴定数据差值不超过0.05 mL。3.4 样品及空白的测定 将 3.1 操作所得的消化液在定氮仪上进行含氮量测定，方法与标准硫酸铵溶液测定相同，并进行空白测定。3.5 结果处理 样品含氮量(mg/mL)=VN14CB)(A 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则 样品中的蛋白质含量(mg/mL)=VN6.2514CB)(A 式中：A 为滴定样品用去的盐酸平均毫升数，B 为滴定空白用去的盐酸平均毫升数，V 为样品的毫升数，C 为盐酸的准确摩尔浓度，14 为氮的原子量，6.25 为系数，N 为样品的稀释倍数。按上面公式计算每毫升标准硫酸铵溶液的含氮量（mg/mL）和每毫升豆浆中蛋白质含量（mg/mL）。四、注意事项(1)如果测定的样品不是纯蛋白，测定的总氮量中很可能包含非蛋白氮，若要进行比较准确的测定，就必须分别测定样品中的蛋白氮和非蛋白氮。后者的测定是将样品制成匀浆或抽提液，用三氯醋酸或氢氧化铜等蛋白质沉淀剂将蛋白质沉淀，然后按测总氮的方法分析上清液，便得到非蛋白氮。把总氮量减去非蛋白氮量即得蛋白氮量。将蛋白氮量乘以 6.25 便是蛋白质的含量。(2)为保证所有硫酸铵都能转化为氨，需要使溶液呈强碱性，所以要加足量的 40%NaOH 溶液。加入时应缓慢进行，以免产生剧烈反应导致接受瓶内硼酸溶液的倒吸和氨的损失。碱液加入后，有铜氨离子、氢氧化铜或氧化铜等化合物生成，溶液呈蓝色或褐色，并有胶状沉淀产生，这是正常现象。反之，如果颜色不变，说明碱液可能不够。(3)蒸馏时要避免火力不稳，否则会发生样品被倒吸到蒸馏瓶的现象。(4)在进行下一次蒸馏时，要先将蒸馏瓶中的热水放掉，加入冷水，否则也会发生样品被倒吸到蒸馏瓶的现象。25 五、思考题(1)写出以下各步的化学反应式 a.蛋白质的消化；b.氨的蒸馏；c.氨的吸收；d.氨的滴定。(2)测定标准硫酸铵和空白的目的是什么？(3)消化时加硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么？（二）双缩脲法测定蛋白质浓度 一、实验原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与 Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用来测定蛋白质的浓度。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于 540 nm 下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。本法测定蛋白质范围 1-10 mg。H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 双缩脲 关于分光光度法测定物质含量的原理介绍如下：分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。因为分光光度法极为灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分的系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质，因此分光光度法目前已成为生物化学研究中广泛使用的方法之一。当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液。入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光 如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射，分散等因素造成的入射光的损失，则 入射光=吸收光+透过光 I0为经过空白校正后入射光的强度；I 为透过光的强度。根据实验得知 I=I010-cL 式中，c 表示吸收物质的摩尔浓度；L 表示吸收物质的光径，用 cm 表示；表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物质的数值不同。所以 0II=10-cL 26 令 T（透射比）=0II，则 T%=0II100 T=10 cL 由上式可得 lgT1=cL lgT1为物质的消光值（E）或吸光度（A）。A=cL 若以 A 对物质的浓度作图，则得一直线。上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比，这就是 BeerLambert 定律。二、试剂与器材 试剂：双缩脲试剂：溶解 1.50 g CuSO45H2O 和 6.0 g NaKC4H4O64H2O 于 500ml 水中，在搅拌下加入 300 ml 10%NaOH 溶解，用水稀释到 1 升，贮存在冰箱中，备用。2 mg/mL 牛血清白蛋白 器材：722 型分光光度计、水浴锅 三、操作步骤 1.取 15 支试管，按下表编号、加试剂 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 样品 牛血清白蛋白(mg)0 0.6 1.2 2.4 3.6 4.8 6.0 2mg/mL 牛血清白蛋白体积(mL)0 0.3 0.6 1.2 1.8 2.4 3.0 待测液体积(mL)3.0*蒸馏水(mL)3.0 2.7 2.4 1.8 1.2 0.6 0 0 OD540 2.各管混匀后，加入双缩脲试剂 3.0 mL，37 oC 反应 30 min。3.以 0 号管调零，测定各管 540nm 光吸收值。四、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的计算 根据样品的 OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。27 五、注意事项 1.须于显色后 30 min 内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。（三）Folin酚试剂法（Lowry 法）测定蛋白质浓度 一、原理 蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与 Cu2+形成络合物。Folin 酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进 Folin 试剂（磷钼酸磷钨酸试剂），蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏 1020 倍，较双缩脲法灵敏 100 倍，反应约在 15 min 内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。对双缩脲反应发生干扰的基团，如CONH2、CH2NH2、CSNH2，在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如 Tris 缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化合物等均可干扰 Folin-酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。在测试时应排除干扰因素或做空白实验消除。浓度较低的尿素（约 0.5%左右）、胍（0.5%左右）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须将碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度提高 1-2 倍。Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。Folin-乙试剂仅在酸性 pH 下稳定，但上述还原反应只在pH10 的情况下发生，故当 Folin-乙试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应能发生。本法可测定范围是 25-250 g 蛋白质。二、试剂和器材 2.1 试剂(1)试剂甲：(A)4%碳酸钠（Na2CO3）溶液 (B)0.2 mol/L 氢氧化钠（NaOH）溶液 (C)2%酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠）(D)1%硫酸铜（CuSO45H2O）溶液 临用前将(A):(B):(C):(D)=50:50:1:1(V/V)混合，此混合液即为试剂甲。混合后的溶液一天内有效。28(2)Folin-酚试剂（试剂乙）在 1.5 L 容积的磨口回流瓶中加入 100 g 钨酸钠（Na2WO42H2O），25 g 钼酸钠（Na2MoO42H20），及 700 mL 重蒸水，50 mL 85%磷酸，100 mL 浓盐酸充分混合，烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出，接上回流冷凝管以文火回流 10 h。回流结束后，加入 150 g 硫酸锂（LiSO4），50 mL 重蒸水及数滴液溴，开口继续沸腾 15 min，以除去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色（如果仍呈绿色，须再重复滴加溴水的步骤），定容至 1 L，过滤，滤液置棕色瓶中保存，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用标准 NaOH滴定酸度，以酚酞为指示剂。该试剂的酸度应为 2 mol/L 左右，将之稀释至相当于 1 mol/L 酸度使用，即为 Folin-酚试剂。(3)标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，再根据其纯度配制成 500 g 蛋白/mL 溶液。2.2 测试样品 血清使用前稀释 100 倍或约含 20-250 g/mL 蛋白质的样品溶液。2.3 器材(1)722 型分光光度计(2)恒温水浴锅(3)试管及试管架(4)0.5mL，1mL 及 5mL 移液管 三、操作方法 3.1 蛋白浓度标准曲线的制作 取 14 支试管，分两组按下表平行操作 试管编号 试剂处理 0 1 2 3 4 5 6 蛋白含量(g)0 25 50 100 150 200 250 标准蛋白溶液(mL)0 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 重蒸水(mL)0.5 0.45 0.40 0.30 0.20 0.10 0 Folin-酚甲试剂(mL)各管加入 4mL 混匀，于 20-25放置 10 min Folin-酚乙试剂(mL)各管加入 0.5mL 迅速混匀，30(或室温 20-25)水浴保温 30 min，以 0 号管为空白对照，在 650nm 处比色 OD650 绘制标准曲线：以 OD650值为纵坐标，标准蛋白量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。29 3.2 样品溶液蛋白质浓度测定 取 6 支试管，分两组，按下表平行操作 试管编组 试剂处理 空白管(3)样品管(3)样品溶液(mL)0 0.5 重蒸水(mL)0.5 0 Folin-酚