《酶切连接与转化》PPT课件

限制性酶切、连接与转化一、酶切一、酶切1、核酸酶的分类：、核酸酶的分类：核酸酶：核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。核酸酶可分为两类：核酸外切酶外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。？如果内切酶可以切掉入侵的病毒DNA，为什么它们不会破坏宿主细胞自身的DNA 限制修饰系统限制修饰系统 简称 R/M系统 restriction modification 类似于免疫体系，他能够识别自己的类似于免疫体系，他能够识别自己的DNA和外和外来的来的DNA，并使外来的，并使外来的DNA降解。降解。由两种酶来控制：修饰的甲基转移酶和核酸限由两种酶来控制：修饰的甲基转移酶和核酸限制性内切酶。制性内切酶。当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细当外源的含有限制性酶特定位点的核酸进入细胞时，相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体胞时，相应的核酸限制性酶就会将其解。但是菌体内的很多核酸也同样含有这样的序列，这时特异的内的很多核酸也同样含有这样的序列，这时特异的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分核酸甲基化酶就起作用了。甲基化酶在内源的部分核酸还没被限制以前就被甲基化了，这种甲基化核酸序还没被限制以前就被甲基化了，这种甲基化核酸序列是限制性酶无法作用的。列是限制性酶无法作用的。2 2、限制性酶切的原理：限制性酶切的原理：限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。3、限制性核酸内切酶的类型和主要特征：、限制性核酸内切酶的类型和主要特征：限制性酶切序列限制性酶切序列5 突出末端突出末端3 突出末端突出末端+5-CCCGGG-33-GGGCCC-55-CCC-OH3-GGG-pp-GGG-3OH-CCC-5SmaI平末端平末端粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端:DNA片段经限制性内切酶切割后,在切割位点处所产生突出的5-或3-单链末端.识别序列限制性内切酶的特点 识别识别 4-8 bp 的回文序列的回文序列.常用的酶识别常用的酶识别 6 bp 发生的概发生的概率为率为 46=4096 bp/每次每次.(44=256 bp;48=65536 bp)高度特异性高度特异性商业化生产商业化生产反应需要反应需要Mg2+不同的内切酶可能产生相同的末端不同的内切酶可能产生相同的末端5 GAATTC 33 CTTAAG 5如如 EcoRI 识别序列识别序列:4.影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素 （1）DNA 纯度纯度 （2）DNA甲基化的程度甲基化的程度 （3）酶切消化反应温度）酶切消化反应温度 （4）DNA的分子结构的分子结构 （5）限制性内切酶的缓冲液）限制性内切酶的缓冲液5、限制性内切酶的星号活性、限制性内切酶的星号活性 类限制酶虽然识别和切割的序列都是有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称的二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶右上角角一个星号表示，因此第二活性又称星号活性。概括起来，诱导星号的因素有以下几种：1,高甘油含量(5%,v/v);2,限制性内切酶用量过高(100u/ug DNA)；3,低离子强度(25mmol/L);4,高ph(8.0以上)；5,含有机溶剂，如DMSD,乙醇等，6,有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）二、二、DNA连接酶与连接酶与DNA分子的体外连接分子的体外连接 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶 来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。T4连接酶作用分三步：T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶AMP复合物。(2)酶AMP复合物结合到具有5磷酸基和3羟基切口的 DNA上，使DNA腺苷化。(1)(3)产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。影响连接效率的因素：影响连接效率的因素：A ATP 浓度浓度 B 连接酶浓度连接酶浓度 C 反应时间反应时间 D insert和和vector的比值（的比值（载体载体DNA和外源和外源DNA的分子的分子数比（浓度比）为数比（浓度比）为1：31：10）E 连接温度连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。三、转化三、转化感受态细胞感受态细胞 (Competent cells):经过 CaCl溶液处理的E.coli 细胞对外源DNA的吸收变得非常敏感，其细胞内的酶限制-修饰系统被抑制，有利于外源基因的转化、表达和繁殖，这种细胞被称作感受态细胞.转化转化 (Transformation):感受态细胞吸收外源DNA的过程.热激热激 (Heat-shock):将 DNA 与宿主细胞混合后，将宿主细胞放入42C 的温水中保温 1.5 分钟以增加转化效率的过程.DNA DNA 克隆的简单流程克隆的简单流程 基因组基因组DNA,PCRDNA,PCR产物产物,cDNA(cDNA(插入子插入子)质粒质粒DNADNA(载体载体)限制性酶切限制性酶切 (修饰修饰 DNA DNA 末端末端)连接载体与插入片段连接载体与插入片段转化转化(将重组质粒导入宿主细胞将重组质粒导入宿主细胞)分析重组子分析重组子 谢谢