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HPLC测定祁连产冬虫夏草中虫草素和虫草酸的含量汪陈才(2008 B,青海师范大学，化学系)摘要 为建立一种有效的利用高效液相色谱法(HPLC)测定冬虫夏草中虫草素和虫草酸 含量的方法，用甲醇超声提取虫草素、水超声提取虫草酸，再利用高效液相色谱、示差折 光检测器和紫外检测器分别测定冬虫夏草中虫草素和虫草酸含量。通过对样品进行预处 理,色谱条件和方法指标的验证，建立了定量检测虫草中虫草素和虫草酸的一种有效方法， 二者精密度(RSD) 038、1.14、 1.9、38|ig/mL的标准溶液。准确称取甘露醇标准样品，用水定容，配制成质量浓度 分别为0.3、3.19、30.88、81.78、104.96 mg/mL的甘露醇标准液，使用前现 配。1.6色谱条件虫草素：色谱柱为 ORBAX SB-C18 柱,(4.6 mmx250mm, 5 pm),柱温 30 C。 检测器为Waters2696二极管阵列紫外检测器(DAD)，检测波长260.4 nm。流动 相 V乙胪：V水=80 ：20，流速0.8 mL/min。用0.5 pm微孔滤膜过滤，进样量10吐。虫草酸：色谱柱为ORBAX SB-C8柱（4.6 mmx250mm, 5）p柱温30C。流动相 V乙主:V = 80 ：20,梯度洗脱，流速0.8 mL/min。检测器为Waters2414示差 折光检测器。用0.5pm微孔滤膜过滤，进样量5 pL。2.结果与分析2.1图谱分析在选定条件下虫草素和虫草酸标准品的高效液相色谱图见图3和图5,即虫 草素在12.384min左右出峰，虫草酸在4.748min左右出峰，虫草素和虫草酸样 品的色谱图见图4和图6,用标准品对照法可在虫草样品图谱中找出虫草素和虫 草酸的相应峰的位置。0.450.40353025200.100,052 4 6 8 10 12 14 16 18 2022 24 26 2830 32 34 保留时B/mi n1图4虫草酸样品色谱图图3虫草素标样色谱图(mo 赳谒V30.00:20.00：0.000.000.00：0.00 f -30.00】246 I 1512 14保留时H/mi m-10.00 -图5虫草酸标样色谱图图6虫草酸样品色谱图2.2数据处理2.2.1虫草素、虫草酸的标准曲线以及线性回归方程量取虫草素标准品0.114、0.38、1.14、1.9、3.8 pg/mL各5 mL进样分 析，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线（图7）；量取虫草酸 标准品 0.3、3.19、30.88、81.78、104.96 mg/mL 各 5 mL 进样分析，以峰面 积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线（图8 ），线性回归方程以及线性范 围见表2。图7虫草素标准曲线图8 虫草酸标准曲线表2虫草素和虫草酸的线性回归方程线性范围线性回归方程相关系数R2检出限虫草素0.114 3.8pg/mLY=4x106X-196810.999650ng/mL虫草酸0.31 104.96mg/LY=11572X-4641.30.99991.5pg/mL注：纵坐标为峰面积，横坐标为质量浓度2.2.2虫草素和虫草酸的组分含量及精密度取冬虫夏草样品，处理方法同1.4节。将虫草素样品重复进样7次，利用标 准曲线法分别计算虫草素和虫草酸的组分含量，利用组分含量计算精密度，其结 果见表3和表4。组分含量计算公式如下:V：浓缩定容后的体积；3 :组分B的含量；m：称样量；X :组分B的质量浓度;BBY：组分B的峰面积。B标准偏差计算公式: 相对标准偏差计算公式：RSD表3虫草素的组分含量及精密度(n=7)虫草素样品的含量3 n： mgg13SD/mgg-1RSD/%虫草素0.2620.2570.2560.2520.2640.2570.2570.2580.0010.39表4虫草酸的组分含量及精密度(n=7)虫草素样品的含量3SD/mgg-1RSD/%虫草素79.378.281.678.478.580.681.179.71.410.392.3回收率准确称取冬虫夏草3份，按1.4节方法处理样品，分别加入不同浓度的虫草 素，定容后进样检测；准确称取冬虫夏草3份，按1.4节方法处理样品，分别加 入不同量的虫草酸，定容后进样检测，结果见表5。表5回收率实验结果成分理论加入量/mg实际测定值/mg回收率/%平均回收率/%虫草素0.50.4896.093.71.01.1190.12.01.995虫草酸4.03.792.598.48.06.986.320.023.3116.53讨论3.1虫草素的提取方法虫草素的提取方法有醇回流、水回流、醇超声、水超声等方法。回流法耗时 过长，对温度的要求高，操作较为繁琐，提取效果一般。采用索氏抽提法和超声 法提取虫草素，可获得相近的结果，但超声提取法更为快捷、简便且准确度高， 操作自动化程度高，受试验环境、温度的影响小。由于虫草素的醇溶性较好，甲 醇能快速渗透到细胞内，故选用甲醇超声波提取法提取虫草素。3.2虫草酸的提取方法虫草酸易溶于水，微溶于醇，不溶于酯、醚。用水与用醇提取虫草素的结果 差别不大，但水提取法更准确，故选用水提取法提取虫草酸。3.3色谱方法本文曾尝试用pH 6.5的磷酸盐(体积比85 ：15 )梯度洗脱，但是虫草素的分离效果不好，无法定性。采用乙腈和水梯度洗脱的方法，可避开盐溶液对仪器和色谱柱损伤较大的缺点，从而建立了 1种有效的分离、测定虫草素的快速、简便的方法。将虫草酸用乙腈：水(体积比80 ：20 )梯度洗脱，虫草酸的分离效果好。4结论建立了高效液相色谱，示差折光检测器和紫外检测器分别测定虫草素和虫草 酸的有效方法。虫草素提取采用甲醇超声波法，虫草酸提取采用水超声波法。虫 草素标准曲线的r2= 0.9996，虫草酸标准曲线的r2= 0.9999。虫草素和虫草酸的 回收率在93.798.4%之间，二者的精密度均1.77%。参考文献1赵余庆，余明，陈立军等冬虫夏草属真菌化学研究概况J中草药，1999,30 (12)： 950 953.2郭宏春，高继全，习欠云等冬虫夏草多糖研究综述J.微生物杂志，2003,23(7):4345.3林津晶，王勇等冬虫夏草国内文献综述海峡药学J.2007，19(05):1401434张智，谢意珍，李森柱.冬虫夏草研究进展J.微生物学杂志,2002,22 ( 5 ) : 5152 张平，朱述钧，钱大顺北冬虫夏草功能成分及作用分析J.江苏农业科学，2003,18(6)： 105106.6刘东泽，陈伟，高新华.虫草菌素(3- 2脱氧腺苷)研究进展J.上海农业学报，2004,20 ( 2 ) : 89937张嘉，李多伟，任静.正交试验提取虫草素的工艺研究J 中国新医药，2004, 3 ( 2 ):34 358黄兰芳，郭方遒梁逸曾HPLC-ESI-MS测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫 草素含量J冲国中药杂志2004,29 ( 8 ) : 77639蔡仲军，尹定华，秦松云.水提取法测定冬虫夏草中甘露醇含量J.重庆中草药研究， 2002, 31( 45):192010王琳，王炯，杨继红.固相萃取高效液相色谱法测定冬虫夏草中的甘露醇J.分析试 验室，2003, 22 ( 6 ) : 8384
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