菜花肝脏DNA的提取及琼脂糖凝胶检测

调节调节pHpH：RNARNA能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而DNADNA对碱较稳定，所以提对碱较稳定，所以提DNADNA一般要在偏碱的环境中提一般要在偏碱的环境中提取，提取，提RNARNA要在偏酸的环境中稳定。要在偏酸的环境中稳定。如提植物如提植物DNADNA一般一般要加要加Tris-Tris-酚（酚（pHpH），提），提RNARNA加水饱和酚（酸酚）加水饱和酚（酸酚）（pHpH）。）。调节盐浓度调节盐浓度(盐的分步沉淀盐的分步沉淀)：在：在浓浓NaClNaCl（1 12M2M）溶液）溶液中，中，DNADNA溶解度大，溶解度大，RNARNA溶解度小溶解度小；在稀；在稀NaClNaCl（）中，（）中，DNADNA溶解度小，溶解度小，RNARNA溶解度大，因此可利用不同浓度的溶解度大，因此可利用不同浓度的NaClNaCl溶液将溶液将DNADNA和和RNARNA从样品中分开。从样品中分开。C.C.除蛋白除蛋白加去垢剂或变性剂加去垢剂或变性剂（SDSSDS，十二烷基硫酸锂，十二烷基硫酸锂LDSLDS，十，十二烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与二烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与DNADNA分分开；开；用有机溶剂沉淀，除去蛋白用有机溶剂沉淀，除去蛋白常用的有机溶剂：苯酚，氯仿，异丙醇，醚等常用的有机溶剂：苯酚，氯仿，异丙醇，醚等本次实验所用：氯仿：异丙醇本次实验所用：氯仿：异丙醇2424：1 1 氯仿：使有机相和水相易分层，增加核酸得率，氯仿：使有机相和水相易分层，增加核酸得率，同时可除去脂类。同时可除去脂类。异丙醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分异丙醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分离。离。D.D.除糖，脂类除糖，脂类 对于含糖量高，含脂高的样品需要做对于含糖量高，含脂高的样品需要做 提取注意事项提取注意事项减少物理因素对减少物理因素对DNADNA的降解。动作轻柔缓慢，尽可能的降解。动作轻柔缓慢，尽可能不要剧烈振荡或搅拌，除破碎细胞，使不要剧烈振荡或搅拌，除破碎细胞，使DNADNA和蛋白分和蛋白分开时开时60607070水浴外，其余操作尽可能在冰浴上进行。水浴外，其余操作尽可能在冰浴上进行。用枪吸核酸时最好用用枪吸核酸时最好用1ml1ml的枪和枪头，枪头必要时可的枪和枪头，枪头必要时可用剪刀剪去一段，防止枪头对用剪刀剪去一段，防止枪头对DNADNA造成机械损伤。造成机械损伤。加蛋白水解酶加蛋白水解酶：如提动物组织中的：如提动物组织中的DNA，常加蛋白酶，常加蛋白酶 K三三.1，5mol/L NaC溶液溶液;2，溶液溶液;3，25%SDS 溶液；溶液；4，24:1 氯仿异戊醇混合液；氯仿异戊醇混合液；5，3mol/L 乙酸钠溶液；乙酸钠溶液；6，95%乙醇；乙醇；7，10 X TBE;8，EB（溴乙啶）（溴乙啶）;9，溴酚蓝指示剂，溴酚蓝指示剂（二）（二）琼脂糖凝胶法检测琼脂糖凝胶法检测DNA琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。其结构单琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物。其结构单元是元是D-半乳糖和脱水半乳糖和脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，构成大网孔型凝胶。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比。比。2.溴化乙锭溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为的入终浓度为的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色该浓度的溶液中染色1015min.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EB染色，染色，则肉眼可见核酸电泳带则肉眼可见核酸电泳带.2.设备与试剂设备与试剂 琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有的有TBE（TrisHCl，硼酸，），硼酸，）3.凝胶制备凝胶制备 用上述缓冲液配制用上述缓冲液配制1%琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至炉加热使之融化，冷至55时加入溴化乙锭（时加入溴化乙锭（EB）至终）至终浓度为，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模浓度为，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板，待胶凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板板，待胶凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下胶浸没在缓冲液下1mm处。处。4.样品制备与加样样品制备与加样 5ul的样品中加入的样品中加入5ul上样缓冲液：含指示染料（溴酚蓝或上样缓冲液：含指示染料（溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（桔黄橙）、蔗糖（10-15）或甘油（）或甘油（5-10），也），也可使用可使用Fico 增加比重，使样品集中，每齿孔可加样增加比重，使样品集中，每齿孔可加样10ul(5-10ug)5.电泳电泳 一般电压为一般电压为5-15V/cm,根据指示剂泳动的位置，判断是根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳否终止电泳(本次实验用本次实验用100V，70mA，2040min)提取完好的提取完好的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱琼脂糖凝胶电泳图谱未除去未除去RNA的的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱琼脂糖凝胶电泳图谱六、实验结果分析讨论七、