环吡酮胺纳米乳的制备及含量测定

环吡酮胺纳米乳的制备及含量测定宋冠男;欧阳五庆;兰莹【摘 要】目的对环吡酮胺纳米乳的配方及制备方法进行研究,并对其理化性质、 稳定性、含量进行考察.方法利用伪三元相图优选配方,制备环吡酮胺纳米乳,通过 透射电子显微镜、激光粒度测定仪、UV分光光度计对其形态、粒径和含量进行考 察,通过高速离心试验和留样观察试验对其稳定性进行考察.结果以乙酸异丙酯为 油相,聚氧乙烯氢化蓖麻油为表面活性剂,乙醇为助表面活性剂,在表面活性剂与助表 面活性剂的质量比Km = 3:2时，室温下可形成稳定的水包油型纳米乳体系；乳滴 呈球形，分布均匀，平均粒径为11.4 nm,多分散系数(PDI)为0.132.稳定性试验显示, 环吡酮胺纳米乳经10 000 r/min离心20 min及在-4,25,60C贮藏6个月后，纳米 乳液仍澄清均一,未出现分层、破乳现象含量测定显示，在306.2 nm处测定纳米乳 液中环吡酮胺含量的专属性良好.结论获得制备环吡酮胺纳米乳的配方,且该配方 制备工艺简单可行,制得的环吡酮胺纳米乳稳定性高.期刊名称】西北农林科技大学学报(自然科学版)年(卷),期】2013(041)003【总页数】7页(P39-44,49) 【关键词】 自乳化机制;纳米乳;载药系统;环吡酮胺;含量测定【作 者】 宋冠男;欧阳五庆;兰莹【作者单位】 西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】R944.9;S859.79+8纳米乳是粒径为1 100nm的乳滴分散在另一种液体介质中形成的热力学稳定的胶体溶液，在化妆品、诊断学、药物治疗和生物技术等领域有广阔的应用前景 1。此外，作为一种新型药物载体2，纳米乳剂型避免了药物与组织和体 液的直接接触；由于其粒径小的特征，纳米乳还具有良好的物理稳定性、缓释性、 靶向性，且可增加难溶药物的溶解度，提高药物的生物利用度，适合多种给药途径 3。近年来，宠物皮肤病的发病率越来越高，约占临床病例的 20%4。宠物皮肤病 的发生不仅对宠物的健康带来极大危害，同时也使人们遭受精神及财产损失。环吡 酮胺属于吡酮类衍生物，常温下为白色结晶性粉末，略溶于水，易溶于甲醇、乙醇 等有机溶剂。它是一种广谱外用抗真菌药，通过抑制真菌细胞的新陈代谢导致细胞 死亡，对皮肤癣菌、霉菌等皮肤致病菌具有较强的抑制和杀菌作用，具有穿透力强 毒性低等特点，可用于体癣、手足癣等体表真菌病以及深部真菌感染的治疗5 8。环吡酮胺属于非激素类药物，长时间使用不会产生耐药性及激素依赖性。近 年来的研究发现，环吡酮胺能够螯合细胞内铁离子而具有抗肿瘤的特性9。但 是，由于环吡酮胺水溶性差，限制了其在临床上的应用。虽然环吡酮胺具有较高的 脂溶性，使得其在经皮吸收过程中，角质层的屏障作用相对较小，但是，在药物由 角质层向生长表皮的转运过程中，由于该层细胞内主要是水性蛋白质溶液，水分含 量约占 90%，所以这一转运过程成为主要的限速因素。药物的溶解性是影响药物 生物利用度的重要因素之一。因为在水中的溶解度小，所以难溶性药物难以被机体 吸收，导致其生物利用度较低10。研究表明，纳米乳作为经皮给药系统，其 透皮效果优于一般制剂，且水包油型纳米乳的流动性明显优于油包水型纳米乳11。纳米乳具有两亲性，其中的疏水基团与皮肤角质层的生物相容性好，可 以增强皮肤对药物的通透性，而亲水集团同时可以进入角质层内部，使其水化膨胀， 进一步增强了药物的透皮效果。纳米乳还能够提高难溶药物的溶解度，并且具有靶 向释药作用，可以富集在病变位置缓慢释放，从而进一步提高生物利用度。 本试验研制了环吡酮胺纳米乳，并对其品质进行了评价，以期为开发临床上治疗宠 物皮肤真菌病的药物新剂型提供理论基础。1材料与方法11 主要药品与试剂环吡酮胺，成都格雷西亚化学技术有限公司生产；蓖麻油聚氧乙烯醚-40(EL-40 )、聚氧乙烯氢化蓖麻油-40(RH-40),德国BASF公司生产；吐温-80(Tween80) ，天津恒星化学试剂制造有限公司生产；乙酸异丙酯、无水乙醇，西安化学试剂厂生产；苏丹红皿，上海试剂三厂生产；亚甲基蓝，天津市福晨化学 试剂厂生产。12 主要仪器BS224S电子天平，德国Sartorius公司生产；JEM - 1230型透射电子显微镜，日本JEOL公司生产；Nicomp 388 / Zeta PALS激光粒度测定仪 ZetasizerNanoZS 型，英国 MaLvern instrument 公司生产；TGL16B 型台式高 速离心机，湖南星科科学仪器有限公司生产； UV - 2450紫外-可见光分光光度 计，日本岛津公司生产。13 环吡酮胺纳米乳的制备131 油相的选择将环吡酮胺原料药分别溶于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、乙 酸异丙酯中，选择溶解度较高的一种作为油相。132 表面活性剂的选择固定溶解度最大的作为油相，分别选用毒性较小的非 离子表面活性剂吐温-80、EL - 40、RH - 40作为表面活性剂，25C下将油相、 表面活性剂按质量比 0.2：9.8,0.4：9.6,0.6:9.4,1：9, 1.5:8.5,2:8,2.5:7.5,3:7的比例搅拌均匀，逐滴滴加蒸馏水，且不 断搅拌，看是否能形成澄清透明的溶液，记录下体系变化临界点的用水量。以油相、 表面活性剂、水相作为相图的3个顶点，绘制伪三元相图，选择纳米乳区最大的 作为表面活性剂12。1.3.3表面活性剂与助表面活性剂质量比(Km )的确定在纳米乳的形成过程中， 助表面活性剂能够降低界面张力、增加界面膜的流动性、调节亲水亲油平衡值(HLB )等。由于环吡酮胺在无水乙醇中具有良好的溶解性，所以选择无水乙醇作 为本配方的助表面活性剂。将选择好的表面活性剂与助表面活性剂无水乙醇分别按 照Km = 2:1,1:1和3:2的质量比混合均匀，再与所选油相依据1.3.2所述 方法制备环吡酮胺纳米乳，记录体系变化临界点的用水量。利用伪三元相图选择最 佳Km值。1.3.4 纳米乳的制备 根据以上初步筛选的处方，并参考文献13制备环吡酮 胺纳米乳。1.4 环吡酮胺纳米乳的形态观察及粒径分析取适量制备好的环吡酮胺纳米乳，稀释5倍，用透射电镜观察形态，用激光粒度 分析仪测定其平均粒径(Z - Average )和多分散系数(PDI)。1.5 环吡酮胺纳米乳结构类型的鉴别在纳米乳中分别滴加亚甲基蓝和苏丹红皿，通过观察2种染色剂在纳米乳中扩散 速度的快慢来判断其结构类型14。1.6 环吡酮胺纳米乳的稳定性考察1.6.1 高速离心试验 取制备的环吡酮胺纳米乳适量放入离心管中，密封后置于 高速离心机，10 000 r / min离心20min后观察。162 留样观察试验将环吡酮胺纳米乳液分装于数个玻璃瓶中，密封后分别置 于冰箱（-4。0、室温（25C）、高温（60C ）及相对湿度75%条件下保存， 分别于3个月和6个月后取样并观察。17 环吡酮胺纳米乳含量的测定1.7.1溶液的配制及最大吸收波长的确定取10 mg环吡酮胺标准品溶于无水乙 醇，定容于100mL容量瓶中；取100mg样品，100mg空白纳米乳，分别用蒸 馏水定容于100mL容量瓶中。用紫外-可见分光光度计在200 400nm波长扫 描环吡酮胺对照品溶液，以无水乙醇为对照，确定最大吸收波长。1.7.2 方法专属性试验 取配制好的环吡酮胺标准品溶液、制备的环吡酮胺纳米 乳溶液、空白纳米乳（未载药纳米乳）溶液适量，用蒸馏水稀释后在环吡酮胺最大 吸收波长处进行扫描。1.7.3标准曲线的建立取质量浓度为0.1 mg/mL的环吡酮胺标准品溶液 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0mL，分别加无水乙醇定容 到10 mL容量瓶中，摇匀。在环吡酮胺最大吸收波长处测定吸收度，以对照品溶 液的质量浓度（pg/mL ）为横坐标，紫外光吸收度为纵坐标，绘制标准曲线，求 标准曲线回归方程。1.7.4 回收率的测定取高（20pg/mL）、中（15 pg/mL）、低（10pg/ mL ） 3个质量浓度的环吡酮胺标准品溶液，加入适量空白纳米乳，用蒸馏水定容 于10mL容量瓶中，测其在最大吸收波长处的吸光值，每个质量浓度重复测量3 次，计算实际浓度、回收率、平均回收率和相对标准偏差。1.7.5进样重复性和精密度试验1）重复性。选择15pg/ mL的待测样品，于 最大吸收波长处重复扫描5次，计算平均质量浓度和相对标准差。 2 ）精密度。取 高（40pg/mL）、中（20pg/mL）、低（15 pg/mL）3个质量浓度对照品 进行紫外扫描。日内精密度在1天之内分别于09：00，10：00，12：00，14： 00和22 : 00进行测定，曰间精密度为每天测1次，共测5d，计算平均质量浓度 和相对标准偏差。2 结果与分析21 环吡酮胺纳米乳配方的确定及制备 纳米乳配方包括油相、表面活性剂、助表面活性剂和水相4个部分。211 油相的选择室温下，经过预试验，环吡酮胺在乙酸乙酯、乙酸异丙酯和 肉豆蔻酸异丙酯中的溶解度分别为0.53,3.40,0. 08mg / mL。为提高载药 量，并考虑到乙酸异丙酯本身流动性好，因此选择乙酸异丙酯作为油相。2.1.2 表面活性剂的选择 以乙酸异丙酯为油相,分别用吐温80、蓖麻油聚氧 乙烯醚（EL-40）、聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40）作为表面活性剂，制备环吡 酮胺纳米乳，均得到澄清透明溶液。通过origin 8 . 0软件绘制伪三元相图，结果 见图 1。由图 1 可以看出,以 RH40 作为助表面活性剂所形成的纳米乳区最大, 说明RH - 40能够使体系更稳定，因此选用RH - 40作为表面活性剂。2.1.3表面活性剂与助表面活性剂Km值的确定以乙酸异丙酯为油相、RH - 40为表面活性剂、无水乙醇为助表面活性剂，RH - 40与无水乙醇的Km值分别为2:1,1:1和3:2,制备纳米乳并绘制伪三元相 图。结果（图2）显示，当Km二3:2时，所形成的纳米乳区最大。2.1.4 环吡酮胺纳米乳的制备 上述结果表明,制备环吡酮胺纳米乳时,以乙酸 异丙酯为油相、无水乙醇为助表面活性剂、RH - 40为表面活性剂，可以得到稳定、 澄清、透明的纳米乳液。当油相与表面活性剂和助表面活性剂混合液的质量比为 1 : 9 ,表面活性剂与助表面活性剂的质量比为3 : 2时,所形成的纳米乳区最大。 因此，环吡酮胺纳米乳最佳配方中各组分质量分数为：RH-40 = 24.48%，无水 乙醇二13 . 83%，环吡酮胺二2.77%,乙酸异丙酯二4.50%,蒸馏水二 54.43%。图1 不同表面活性剂对环吡酮胺纳米乳形成的影响阴影部位为纳米乳区，下图同Fig1 Effects of surfactant on the formation of ciclopirox olamine nanoemulsion The shaded area is nanoemulsion region，same for following figures图2不同Km值对环吡酮胺纳米乳形成区域的影响Fig . 2 Effects of Kmto formation of ciclopirox olamine nanoemulsion22 环吡酮胺纳米乳的形态及粒径分布经电镜观察，环吡酮胺纳米乳滴呈圆形，分布均匀（图3）。平均粒径为11.4nm，多分散系数（PDI ）为0.132,粒径分布在10 20nm的粒子约占73% （图4 ） 。由于乳滴粒径小，无粘连，粒径分布范围较窄，所以纳米乳外观上 澄清、透明、黏度小。图3透射电镜下环吡酮胺纳米乳的形态（x50 000 ）Fig.3 Shape of ciclopirox olamine nanoemulsion by transmission electron microscope （x50 000 ）2.3 环吡酮胺纳米乳的结构类型如果亚甲基蓝的扩散速度快于苏丹红皿，则表明制备的纳米乳类型为水包油型，反 之则为油包水型；如果亚甲基蓝和苏丹红皿的扩散速度一样，则制备的纳米乳类型 为双连续型。经染色后可以观察到，苏丹红皿在环吡酮胺纳米乳中几乎不扩散，亚 甲基蓝在纳米乳中的扩散速度明显快于苏丹红皿。由于亚甲基蓝易溶于水而苏丹红 皿易溶于油类，这表明本研究所制备的环吡酮胺纳米乳类型为水包油型。2.4 环吡酮胺纳米乳的稳定性 高速离心试验和留样观察试验结果显示，纳米乳仍澄清透明，未出现破乳现象，说 明环吡酮胺纳米乳稳定性良好。2.5 环吡酮胺纳米乳含量的测定2.5.1 环吡酮胺最大吸收波长的确定 经过紫外扫描，环吡酮胺对照品溶液的最 大吸收波长在306.2 nm处。2.5.2方法专属性试验在306 . 2nm处，环吡酮胺标准品有最大吸收，而空白 纳米乳无吸收(图5)。 表明辅料在此波长处无干扰，该方法专属性好。图 4 环吡酮胺纳米乳的粒径分布 Fig . 4 Size distribution of ciclopirox olamine nanoemulsion2.5.3标准曲线的制作图6表明，当质量浓度为040pg/mL时，环吡酮胺 的质量浓度(X )与吸光度(Y )呈良好的线性关系，拟合的线性方程为Y二 0 . 027 7 X + 0.010 6,R2 = 0.998 3。图5环吡酮胺纳米乳的紫外吸收图谱Fig . 5 Ulraviolet absorption curves of ciclopirox olamine图 6 环吡酮胺的标准曲线 Fig . 6 Standed curve of ciclopirox olamine 2.5.4回收率及样品含量测试选择10,15,20 pg/mL 3个质量浓度进行测 试，每个质量浓度测定3次，结果(表1)显示，平均回收率为100.59%，相对 标准偏差为1.42%,说明此方法测定结果准确度较高。表1环吡酮胺回收率的测定结果Table 1 Recovery rate test of Ciclopirox olamine样品质量浓度/(pgmL- 1) Sample concentration实测质量浓度/ (pgmL- 1) Measured concentration 回收率 / %Recovery rate 平均回收率 / %Average recovery rate 相对标准偏差 / %RSD ( Relative standard deviation)10 10.22 102.1710 10.22 102.1610 10.22 102.1615 15.11 100.7615 15.11 100.73 100.591.43 1.4215 15.11 100.7520 19.78 98.8820 19.78 98.9220 19.77 98.832.5.5进样重复性及精密度试验重复性试验选择15pg/ mL环吡酮胺样品进行 测定，结果表明，平均质量浓度为(15 .280.03)pg/mL,平均回收率为（10188021）%，相对标准偏差为021%。精密度试验选用15，20和 40pg/ mL 3个质量浓度测定，日内、曰间精密度的相对标准偏差分别为1. 64% 和167%。说明此方法测定精密度较高。3讨论自从1943年Schulman和Hoar 15 最早提出纳米乳可以作为一种分散体系以 来，学术界逐渐掀起对纳米乳研究的热潮。而纳米乳作为透皮给药系统，一直是国 内外研究的一个热点。Kreilgaard等16研究了利多卡因和盐酸丙胺卡因纳米 乳，发现纳米乳经皮给药系统对难溶性药物具有增溶作用，给药后可产生较高的渗 透浓度梯度，透药量比传统的水包油型乳化剂提高了4倍。何欣等17研制了 水包油型雷公藤多甙纳米乳，发现其具有良好的透皮效果。纳米乳作为透皮给药系 统，能够提高药物的生物利用度和透皮率1819。一方面，由于纳米乳粒径 小，表面张力低，能够改变药物的渗透浓度梯度，使透皮药物均匀分散在皮肤表面， 水包油型（O/W ）的小液滴（粒径小于100nm ）能够高效地透过皮肤表面，提 高了纳米乳装载的有效成分的穿透率，从而促进透皮吸收20；另一方面，用 纳米乳作为环吡酮胺药物的载体，避免了药物与皮肤的直接接触，在皮肤表面停留 时间长，延长了药物的作用时间，所以提高了药效。本研究制备的纳米乳类型为水 包油型，易吸收且清爽，粒径小，澄明度高，黏度小，不油腻，使用方便，克服了 传统乳膏剂制备工艺复杂、质量难以控制、涂展性差、不易清洗等缺点。 本研究以乙酸异丙酯作为油相，是由于乙酸异丙酯流动性好，对药物的溶解度较高。 本试验以乙醇作为助表面活性剂，一方面是由于乙醇可以提高体系的稳定性，可插 入到界面膜中，进一步降低界面张力，从而提高纳米乳的稳定性21；另一方 面是因为乙醇是环吡酮胺很好的溶剂，可以提高环吡酮胺纳米乳的载药量。利用伪 三元相图分析表明，使用RH - 40作为表面活性剂且其与助表面活性剂的Km二 3:2时，形成的纳米乳区最大，此时系统最为稳定。在稳定性试验中，纳米乳均 澄清透明，无分层、破乳现象出现，表明本制剂稳定性良好；在透射电镜下观察， 乳滴呈圆形，无粘连；经扫描电镜分析，其平均粒径为11.4nm , PDI为 0.132;亚甲基蓝染色剂在纳米乳液中的扩散速度快于苏丹红皿，表明本研究制 备的乳液类型为水包油型，且各项指标均符合纳米乳性质要求。使用本方法制备纳 米乳，工艺简单，便于大规模推广，为临床上环吡酮胺药物新剂型的应用提供了理 论基础。但是，在纳米乳的制备过程中，需要加入一定剂量的表面活性剂，而表面活性剂具 有一定的毒性，如何减少纳米乳形成过程中表面活性剂的用量，是今后纳米乳制备 领域中需要解决的问题。参考文献【相关文献】1 Gutierrez J M,G on zalez C, Maestro A , et al. Nano - emulsio ns : New applications and optimization of their preparation J.Current Opinion in Colloid amp Interface Science , 2008 , 13（4） : 245251 .2 Shah P,Bhalodia D,Shelat P.Nanoemulsion:A pharmaceutical reviewJ.Syst Rev Pharm , 2010（1） : 2432 .3 Abhijit A D,Neha D,Rahul D.Selfnanoemulsify drug delivery systems: formulation insights,applications and advances J . Nanomedicine , 2010 , 5（10） : 15951616.4 卜春华,杨惠超,黄文峰,等.宠物犬常见皮肤病的种类及病因 J .中国畜禽种业, 2008（6）:5859.Bu C H,Yang H C,Huang W F,et.al.Common types of skin diseases and causes of pet dogsJ.The Chinese Livestock and Poultry Breeding , 2008 （6）:5859.（in Chinese）5 Kokjohn K,Bradley M,Griffiths B,et al.Evaluation of in vitro activity of ciclopirox olamine,butenafine HCL and econazole nitrate against dermatophytes,yeasts and bacteriaJ.International Journal of Dermatology , 2003 , 42（S1） : 1117 .6 Almeida B , SampaioMarques B,Carvalho J,et al.An atypical active cell death process underlies the fungicidal activity of ciclopirox olamine against the yeast Saccharomyces cerevisiaeJFEMS Yeast Research，2007，7(3)：4044127 Gupta A K，Plott TCiclopirox：a broadspectrum antifungal with antibacterial and antiinflammatory propertiesJInternational Journal of Dermatology，2004，43 (S1)：388 Oliveira P C，Medeiros C S，Macedo D P，et alCiclopirox olamine：an antifungal alternative against cryptococcosisJLett Appl Microbiol，2010，51(5)：4854899 Weir S J，Patton l，Castle K，et alThe repositioning of the antifungal agent ciclopirox olamine as a novel therapeutic agent for the treatment of haematologic malignancyJJ Clin Pharm Ther，2011，36(2)：12813410 Chen H，Khemtong C，Yang X，et alNanonization strategies for poorly water soluble drugsJDrug Discovery Today，2011，16：35436011 Lee P J，Langer R，Shastri V PNovel microemulsion enhancer formulation for simultaneous transdermal delivery of hydrophilic and hydrophobic drugs JPharmaceutical Research，2003，20(2)：26412 周江，严琴英，杨根生伪三元相图在紫杉醇自乳化制剂筛选中的应用J.浙江化工，2007，38(8)：1315Zhou J，Yan Q Y，Yang G SApplication of pseudoternary phase diagrams for paclitaxel in selfemulsifying drug delivery system J.Zhejiang Chemical Industry，2007，38(8)：1315.(in Chinese)13 李树鹏，郝艳霜，欧阳五庆.黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳的制备及免疫佐剂效应研究J.西北农林科技大学学报：自然科学版，2011,39 ( 10 ):10 - 16.Li S P , Hao Y S ,Ouyang W Q . Preparation of WO Astragalus polysaccharide and echinacea extra ct based nanoemulsion and its amplified immune responseJ.Journal of Northwest AF University：Natural Science Edition，2011，39(10)：1016.(in Chinese )14 张阳德纳米药物学M 北京：化学工业出版社，2005 : 163 - 188 . Zhang YD.Nano pharmaceutics M . Beijing ： Chemical Industry Press，2005：163188.(in Chinese)15 Schulman J H，Hoar T P.Transparent waterinoil dispersions：The oleopathic hydromicelleJ.Nature，1943，152：102103.16 Kreilgaard M，Kemme M J，Burggraaf J.Influence of a microemulsion vehicle on cutaneous bioequivalence of a lipophilic model drug assessed by microdialysis and pharmacodynamicsJ.Pharm Res，2001，18(5)：593599.17 何 欣，赵兴华，欧阳五庆，等.雷公藤多甙纳米乳透皮制剂的制备及体外释药研究J 黑龙江畜牧兽医，2010 , 17 : 129 - 131 . He X , Zhao X H , Ouyang W Q,et al.Preparation of tripterygium glycosides nanoemulsion as transdermal drug delivery system and drug release study in vitro J.Heilongjiang Ani-mal Science and Veterinary Medicine，2010，17：129-131.(in Chinese)18 Venkata Ramana Rao S，Shao JSelfnanoemulsifying drug delivery systems （SNEDDS）for oral delivery of protein drugsJInternational Journal of Pharmaceutics，2008，362：2919 Shakeel F，Baboota S，Ahuja A，et alCelecoxib nanoemulsion：Skin permeation mechanism and bioavailability assessmentJJ Drug Target，2008，16 （10）：73374020 Bouchemal K，Briancon S，Perrier E，et alNanoemulsion formulation using spontaneous emulsification：Solvent，oil and surfactant optimisationJInternational Journal of Pharmaceutics，2004，280：24125121崔福德药剂学M.6版北京：人民卫生出版社，2008 : 391 - 394 . Cui F DPharmacyM6th editionBeijing：Peoples Health Press，2008：391 394（in Chinese）