硅胶柱层析原理

硅胶柱层析原理硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸 附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。编辑木段硅胶柱层析流动相极性小的用乙酸乙酯：石油醚洗脱；极性较大的用甲醇：氯仿洗脱； 极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸洗脱；拖尾可以加入少量氨水或冰醋 酸编辑木段硅胶柱层析惯用方法1. 称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以 用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用 烧杯量100ml也可以。2. 搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗 脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿 /醇 体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠 久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去 1%的醇。如果样品对酸敏感， 不能用氯仿体系过柱。3. 装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯 仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降， 会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。4压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直 至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进 行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开 裂。5. 上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱 剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱 剂，而不会冲坏硅胶表面。6. 过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml 收一馏分；1-2g 上样量，50g 硅胶（200-300 目）, 20-50ml 收一馏 分。7检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产 品，紫外的灵敏度一般比喷显剂低1-2个数量级。8送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少 或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱 1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。汪意事项1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质 Rf值之差最大化 2将柱子必须装平整、均匀3. 考虑有限柱填料的吸附量4. 可考虑用梯度法分开并洗脱TLC 方法的建立，主要是“展开剂的选择”与“显色方法的确定”等两方面的工作。 1、展开剂的选择 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷 己烷苯 乙WTHF乙酸乙酯 丙酮 乙醇Petroleumether/Ethylacetate,petroleumether/Acetone,Petroleumether/Ether,Petroleumether/C H2Cl2, ethylacetate/MeOH,CHCl3/ethylacetate 展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试 使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。展开剂的选择条 件：对所需成分有良好的溶解性;可使成分间分开;待测组分的Rf在0.20.8之间， 定量测定在0.30.5之间；不与待测组分或吸附剂发生化学反应；沸点适中，黏度较 小; 展开后组分斑点圆且集中; 混合溶剂最好用新鲜配制。一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙 酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离; 中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于 蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离;强极性溶剂，由正丁醇和水组成， 也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。 很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。一般把两种溶剂 混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例（或者 加入第三种溶剂）,达到最佳效果;如果没有分开的迹象（斑点较“拖”），最好是换溶剂。对 于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等 碱性物质来中和硅胶的酸性。（选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨 水无疑是较好的选择。）分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系：不同厂家生产 的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中 分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的 影响。温度，湿度对分离效果影响也很明显，在实验中我们发现有时同一展开条件，上下午 的Rf截然不同 展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑 在进行薄层层析时，首先应该知道未知化学成分的类型，其极性的大致归属，从提取液或从 色谱柱的流动相极性可知，另外某样品里含多种化学成分先按极性不同大致分，然后细分， 对于分离未知的化学物质，展开剂的选择也是一个摸索的过程，不应该仅仅从展开剂考虑， 多因素综合衡量！ 溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混 合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离 物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑，在用极性吸附剂进行层析时，当被分 离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂;被分离物质为强极性成分，则须选用 极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替 硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用干法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。 溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。 这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐 个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有 时可以用溶剂的介电常数（）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适 用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反， 在水或亲水性溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。 被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此 紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的 结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附性强。当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的性能就会更 大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差 别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度， 与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性 很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性 溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附 剂（一般IIIW级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以 判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂 梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多 组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸酯和脂肪酸等组份。当以 硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即可按 其极性大小的不同依次被洗脱。又如对于 C-27 甾体皂甙元类成分，能因其分子中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙 元溶于含有5氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改 用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低， 亦即采用苯或含5氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明， 同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从 而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。（二）簿层层析：薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将柱层析用的吸附剂 撒布到平面如玻璃片上，形成一薄层进行层析时，即称薄层层析。其原理与柱层析基本相似。 1薄层层析的特点：薄层层析在应用与操作方面的特点与柱层析的比较。 2吸附剂的选择：薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层 析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250 目，并要求粒度均匀。用于薄层层析 的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以IIIII级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细 而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10 厘米，否则可引起色谱扩散影响 分离效果。3展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如II或III级）对多组分的样品能 否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极 性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。但在实际工作中，经常需要利用溶剂的极 性大小，对展开剂的极性予以调整。二、TLC板显色剂的分类与应用： 一般来，采用紫外光吸收显色是最常见，也是最方便的。只有当“紫外光吸收显色”不能使用 时，才采用下列显色剂显色。1、常用显色剂：硫酸常用的有四种溶液：硫酸-水（1： 1）溶液；硫酸-甲醇或乙醇（1： 1）溶液；1.5mol/L硫 酸溶液与0.5-1.5mol / L硫酸铵溶液，喷后110oC烤15min,不同有机化合物显不同颜色。 0.5%碘的氯仿溶液对很多化合物显黄棕色。 中性 0.05高锰酸钾溶液 易还原性化合物在淡红背景上显黄色。 碱性高锰酸钾试剂 还原性化合物在淡红色背景上显黄色。溶液I： 1 %高锰酸钾溶液；溶液II： 5 %碳酸钠溶液；溶液I和溶液II等量混合应用。 酸性高锰酸钾试剂 喷 1.6%高锰酸钾浓硫酸溶液 (溶解时注意防止爆炸 )，喷后薄层于 180oC 加热 1520min。 酸性重铬酸钾试剂 喷5%重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150oC烤薄层。 5%磷钼酸乙醇溶液喷后120oC烘烤，还原性化合物显蓝色，再用氨气薰，则背景变为 无色。 铁氰化钾-三氯化铁试剂 还原性物质显蓝色，再喷 2molL 盐酸溶液，则蓝色加深。 溶液I： 1%铁氰化钾溶液；溶液II： 2%三氯化铁溶液；临用前将溶液I和溶液II等量混合。2专属性显色剂： 由于化合物种类繁多，因此专属性显色剂也是很多的，现将在各类化合物中最常用的显色剂 列举如下：(1) 烃类 硝酸银/过氧化氢 检出物：卤代烃类。溶液：硝酸银O.1g溶于水Iml,加2-苯氧基乙醇100ml，用丙酮稀释至200ml，再加30%过 氧化氢 1 滴。方法：喷后置未过滤的紫外光下照射； 结果：斑点呈暗黑色。 荧光素/溴 检出物：不饱和烃。溶液：I.荧光素0.1g溶于乙醇lOOml； II. 5%溴的四氯化碳溶液。方法：先喷(I),然后置含溴蒸气容器内，荧光素转变为四溴荧光素(曙红)，荧光消失，不饱 和烃斑点由于溴的加成，阻止生成曙红而保留荧光，多数不饱和烃在粉红色背景上呈黄色 四氯邻苯二甲酸酐检出物：芳香烃。溶液： 2%四氯邻苯二甲酸酐的丙酮与氯代苯(10： 1)的溶液。 方法：喷后置紫外光下观察。 甲醛/硫酸 检出物：多环芳烃。溶液：37%甲醛溶液O.2ml溶于浓硫酸l0ml。(2) 醇类 3, 5 一二硝基苯酰氯 检出物：醇类。溶液：I. 2%本品甲苯溶液；II. 0.5%氢氧化钠溶液；III. 0.002%罗丹明溶液。方法：先喷(I),在空气中干燥过夜，用蒸气薰2min，将纸或薄层通过试液(II)30s,喷水洗， 趁湿通过(III)15s，空气干燥，紫外灯下观察。 硝酸铈铵 检出物：醇类。溶液：I. 1%硝酸铈铵的0.2mol / L硝酸溶液；II. N,N-二甲基-对苯二胺盐酸盐1.5g溶于 甲醇、水与乙酸(128m1+25m1+1. 5m1)混合液中，用前将(I)与(II)等量混合。喷板后于105oC 加热 5min。 香草醛/硫酸检出物：高级醇、酚、甾类及精油。溶液：香草醛1g溶于硫酸lOOml。方法：喷后于 120oC 加热至呈色最深。 二苯基苦基偕肼 检出物：醇类、萜烯、羰基、酯与醚类。溶液：本品15mg溶于氯仿25ml中。方法：喷后于110oC加热5lOmin。结果：紫色背景呈黄色斑点。(3) 醛酮类 品红/亚硫酸 检出物：醛基化合物。溶液：I. 0.01%品红溶液，通入二氧化硫直至无色；II. 0.05mol / L氯化汞溶液；III. O.05mol / L 硫酸溶液。方法：将I、II、III以1： 1： 10混合，用水稀释至l00ml。 邻联茴香胺 检出物：醛类、酮类。溶液：本品乙酸饱和溶液。 2, 4-二硝基苯肼 检出物：醛基、酮基及酮糖。溶液：I. 0.4%本品的2mol / L盐酸溶液；II .本品O.1g溶于乙醇l00ml中，加浓盐酸lmlo方法：喷溶液I或II后，立即喷铁氰化钾的2mol / L盐酸溶液。 结果：饱和酮立即呈蓝色；饱和醛反应慢，呈橄榄绿色；不饱和羰基化合物不显色。 绕丹宁 检出物：类胡萝卜素醛类。溶液： I. 1%5%绕丹宁乙醇溶液；I. 25%氢氧化铵或27%氢氧化钠溶液。方法：先喷溶液I,再喷溶液II,干燥。(4) 有机酸类溴甲酚绿 检出物：有机酸类。溶液：溴甲酚绿0.1g溶于乙醇500ml和0.1mol/L氢氧化钠溶液5ml。方法：浸板。结果：蓝色背景产生黄色斑点。 高锰酸钾/硫酸检出物：脂肪酸衍生物。 溶液：见通用显色剂酸性高锰酸钾。 过氧化氢 检出物：芳香酸。溶液： 0.3%过氧化氢溶液。方法：喷后置紫外光(365nm)下观察。 结果：呈强蓝色荧光。 2, 6-二氯苯酚-靛酚钠 检出物：有机酸与酮酸。溶液：0.1%本品的乙醇溶液。 方法：喷后微温。 结果：蓝色背景呈红色。/THF乙酸乙酯 丙酮 乙醇