泛素介导的蛋白质降解与肿瘤发生

泛素介导的蛋白质降解与肿瘤发生 李艳凤, 张 强, 朱大海 （中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院, 北京 100005）摘 要 : 泛素介导的蛋白质降解途径是降解细胞内蛋白质的主要途径, 在维持细胞正常的蛋 白质代谢中起着至关重要的作用。泛素介导的蛋白质降解途径的异常与许多疾病特别是肿瘤 的发生密切相关。通过介绍泛素介导的蛋白质降解途径在细胞周期、DNA修复、细胞凋亡 中的作用, 系统阐述了泛素介导的蛋白质降解途径与肿瘤发生的关系。关键词：基因表达调控；泛素；蛋白质降解；细胞周期；DNA修复；细胞凋亡；肿瘤发生中 图 分 类 号 :Q519文 献 标 识 码 : A文章编号： 0253-9772(2006)12-1591-06The Ubiquitin-Proteasome Proteolytic Pathway and TumorigenesisLI Yan-FenG, ZHANG Qiang, ZHU Da-Hai(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of MedicalSciences & Peking Union Medical College, Beijing 10005, China)Abstract： The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway, a major pathway for protein degradation in cells, plays a critical role in the protein metabolism. So abnormality of the ubiquitin-proteasome proteolytic pathway is closely related to many diseases, especially cancer. In this paper, we reviewed the study of the significant role of the ubiquitin-proteasome proteolytic pathways during the cell cycle, DNA repair and apoptosis, especially the relationship between these pathways and tumorigenesis.Key words： gene expression and regulation； ubiquitin； protein degradation； cell cycle； DNA repair； apoptosis； tumorigenesis蛋白质是执行生命活动的基本分子, 细胞中的蛋白质不断地处于合成、修饰与降解的代谢更 新过程中。保持细胞正常的蛋白质代谢对于生命的正常功能至关重要。目前所知蛋白质的降 解主要通过两种途径： 溶酶体降解途径和泛素介导的蛋白酶体降解途径。溶酶体降解途径是 一个非选择的蛋白质降解途径, 主要降解通过摄粒作用或胞饮作用进入细胞内的外源蛋白 质； 而泛素介导的途径是一个受到严格的时空调控的特异性蛋白质降解途径, 被降解的蛋白 通过 El（泛素激活酶，Ubiquitin-activating enzyme）、E2（泛素偶联酶，Ubiquitin-conjungating enzyme）和E3（泛素连接酶,Ubiquitin ligase）一系列的作用与多个泛素共价结合后被蛋白酶复 合体（Proteasome）识别并降解。泛素介导的蛋白质降解参与到细胞周期1、炎症反应2、细 胞凋亡3、抗原提呈4等许多生命过程中。因此， 泛素介导的蛋白质降解途径的异常与许 多疾病， 如恶性肿瘤、肌肉萎缩等的发生密切相关。本综述主要从细胞周期、 DNA 修复和 细胞凋亡几个方面来介绍泛素介导的蛋白降解与肿瘤发生之间的关系。1 泛素介导蛋白质降解与细胞周期 细胞周期调控因子主要包括：细胞周期蛋白(Cyclin)、周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase, CDK)和 CDK 抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase inhibitors, CKI)。细胞周期的正常进 行需要细胞周期蛋白和其他蛋白质的降解, 泛素介导的蛋白质降解在此过程中起着至关重 要的作用。根据泛素连接酶的不同, 参与细胞周期调控的泛素介导的蛋白质降解途径可分为两类： 依赖 SCF(Skpl-Cullin-F-box protein)的泛素化途径和依赖 APC (Anaphase- promoting complex)的泛 素化途径。1.1依赖SCF的泛素化途径与细胞周期SCF 主要包括 5 种组分:F-box 蛋白、Skp1、CuHins、ROC1/Rbx1/Hrt1 和 Nedd8/Rub1。其中 F-box蛋白是一大类蛋白的统称，其F-box结构域与Skp1结合，其他区域具有对底物的识别 作用5。SCF复合物主要参与G1/S期调控因子的泛素化降解，如Cyclin D、Cyclin E、p27Kip1等。Cyclin D是细胞周期中G1/S期重要的调控因子，它与CDK4/6结合，使Rb蛋白发生磷酸化 而失活， 释放出转录因子 E2F， 转录因子进入细胞核内， 使促进 G1/S 期所需的调控基因表 达。细胞周期进入S期后,Cyclin D被磷酸化后由SCF泛素化途径降解。Cyclin E在G1期 到S期的早期与CDK2结合，启动DNA的复制，与Cyclin D 一样，细胞进入S期后被降解。 p27Kip1是调节Cyclin D/CDK4和Cyclin E/CDK2重要的CKI蛋白，它在处于静止和G1期 的细胞中大量存在，而在处于增殖和S期的细胞中被依赖SCF的泛素化途径所降解(图1)。1.2依赖APC的泛素化途径与细胞周期APC 介导的泛素化途径更加复杂。它与姊妹染色单体分离、纺锤丝解聚、胞质分裂、细胞 脱离有丝分裂和细胞重新进入G1期都有着密切的关系。APC是一个20S的蛋白复合体，包 含1012个亚基，它定位于纺锤丝微管和中心粒上。APC的作用底物都含有共同的由9个氨 基酸组成的保守区称为“破坏框”(Destruction Box)。APC的激活有两种蛋白参与，分别为CDC20和Cdh1CDC20的表达受细胞周期的调控，在 G1期向S期过渡时开始合成，到M期含量最高,M末期被降解，因此在M期中期激活APC; 而Cdh1在G1期存在，所以在G1期激活APC。它们分别控制细胞周期M期中后期到M期 末和M期末到G1期向S期的过渡。APC可以监控微管是否与着丝点正确连接，只有当所 有的着丝点都与微管相连接,APC才能被激活，启动M期中期向后期的过渡。Cyclin A是在S期和G2期稳定存在的细胞周期蛋白。细胞通过M期需要Cyclin A的降解，若 Cyclin A不被降解则会引起细胞周期停止在M期的中期。Cyclin B在细胞周期G2的中晚期 逐渐积累，使得细胞进入M期。如果Cyclin B的降解受到抑制，将会使细胞周期停滞在M 期后期oCyclin A和Cyclin B都是由CDC20激活的依赖APC泛素化途径所降解的(图1)5,6。图 1 泛素连接酶 SCF 和 APC 对细胞周期进程的调节5,6Fig. 1 The function of SCF and APC in cell cycle5,61.3 SCF和APC的异常与肿瘤发生细胞周期蛋白受到SCF和APC的严密调控oSCF和APC 一旦发生异常，就会使细胞周期调 控失常而发生肿瘤。Skp2是一种F-box蛋白，其与Cksl等蛋白形成的SCFSkp2复合体是介导p27等因子降解的 泛素连接酶。许多研究表明，Skp2是一个癌基因。Skp2的高表达与肿瘤的恶性和浸润性以 及多种肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌等的预后不良密切相关7， 同时也有研究表 明Cksl的咼表达与乳腺癌等具有密切的关系8。Shibahara等人的研究表明，用乙酸苯酯 (Phenylacetate, PA处理前列腺肿瘤细胞后,Skp2表达水平降低,p27水平升高，从而导致细胞 增殖停滞， 表明 Skp2 可以作为其相关肿瘤治疗的药物靶点9。另外一个SCF连接酶SCFFbw7,负责降解多种癌蛋白，如c-Myc、N-Myc、c-Jun, Cyclin E、 Notch1/4等。而在卵巢癌细胞系和16%的子宫内膜腺癌中FBW7基因发生突变，其中多 数为FBW7的杂合缺失10,11。关于APC在肿瘤中的研究表明,APC的两个亚单位APC6/CDC16和APC8/CDC23常常在人 结肠癌中发生突变而失活 12， 恶性和预后不良的乳腺癌中常见 APC7 失活13。 G1 期 APC/CCdh1的失活导致其底物Skp2和Cks1的累积，从而促进细胞过早的进入S 期,而APC 的失活也会导致Cyclin A、Aurora-A和Securin的累积从而导致染色体的不正常分离。此外 APC的失活也可能是由于Emi1的过表达造成的，许多肿瘤中Emi1的RNA和蛋白质水平都 是很高的, 如乳腺癌, 肺癌, 结肠癌, 卵巢癌等14。2泛素介导蛋白质降解与DNA修复2.1 p53泛素化调节在DNA修复中的作用p53自1979年被发现以来一直都是科学研究的热点之一,p53是“基因组的守护者”当DNA 受到损伤或发生不正常的细胞增殖时p53就会被激活，使细胞周期停止或使细胞发生凋亡。 p53 作为转录因子可以诱导细胞周期抑制因子和促凋亡基因的表达 , 如 p21、 Apaf1、 p53AIP1 和 Bcl-2 家族成员。2.1.1泛素介导的蛋白质降解与p53蛋白水平的调节 p53 作为一个潜在的细胞周期抑制因子和细胞凋亡的诱导因子, 其表达水平和活性受到严格 的控制。早期的研究表明p53的半衰期只有30分钟。Maki等人用蛋白酶体抑制物MG-132 处理细胞发现p53蛋白的水平升高15,由此可知细胞中p53蛋白水平的调节主要是通过泛 素介导的蛋白质降解途径来实现的。早期的研究发现降解p53的E3连接酶有E6-AP和Mdm2。E6-AP只是在感染人乳头瘤病毒 的细胞中调节p53的水平，不占主要地位；Mdm2则是正常细胞中调节p53蛋白质水平的主 要因素。 Mdm2 可以募集转录抑制因子 CtBP2 与 p53 的转录激活区结合并抑制其转录16, Mdm2自身作为一个E3连接酶可以促进p53的泛素化降解17。2.1.2调节p53的泛素降解途径与肿瘤发生细胞在受到不正常的激活或者DNA受到损伤时,p53会调节细胞走向凋亡或者使它对凋亡刺 激更加敏感, 但是如果 p53 正常的监控系统发生突变, 则会发生肿瘤。 50%肿瘤中 p53 发生 了突变，而那些具有正常的p53蛋白的肿瘤往往在激活或对p53的反应方面有缺陷。其中，由 于调节p53的泛素化降解途径的异常产生的肿瘤占很大部分。研究表明，10%的肿瘤中Mdm2 的表达异常升高。因此，在治疗方面，人们把越来越多的研究集中在调节p53的泛素化降解 途径方面，特别是负责降解p53的泛素连接酶E6-AP和Mdm2,并且取得了一定的成果。例 如,Higashitsuji H等18发现Gankyrin蛋白可以与Mdm2结合并促进其活性，加速p53的泛 素化降解；相反，抑制Gankyrin蛋白活性则能够促进肿瘤细胞凋亡。因此，Gankyrin蛋白可 以作为一个肿瘤治疗的药物靶点。2.2 BRCA1在DNA修复中的作用BRCA1是另外一个在DNA修复中发挥重要功能的分子BRCA1蛋白是一种泛素连接酶，其 N端具有一个RING结构域，该结构域可以同一个与其结构类似的蛋白质BARD1(BRCA1 associated RING domain)结合。BARD1结合能够增强BRCA1泛素连接酶的活性，并可以增 强其稳定性19。2.2.1 BRCA1 与 DNA 修复当DNA复制发生损伤时,BRCA1即与损伤区域的BARD1、Rad51和PCNA结合20RAD51 在酵母中的同源蛋白可以通过同源重组的方式修复酵母的DSBs(DNA double-strand breaks)。 BRCA1与BARD1的结合暗示了其在DNA修复中的作用。此外,BRCA1缺失的细胞不能够 通过同源重组的方式修复染色体上的DSBs,这一点也证明了 BRCA1在DNA修复中的作用210BRCA1还可以和RAD50- MRE11-NBS1复合体结合,RAD50也是一种DNA修复蛋白, 该复合体是一个具有多个亚基的核酸内切酶， 编码该复合体的基因发生突变则会导致 DNA 损伤敏感和基因组的不稳定22。2.2.2 BRCA1 与肿瘤发生 除了在DNA修复中拌有重要的角色外,BRCA1还参与基因的转录调节、细胞凋亡和中心体 复制等过程。因此, BRCA1 的突变与肿瘤的发生密切相关。BRCA1 是乳腺癌和卵巢癌的易感基因, 是乳腺癌研究中的热点。在乳腺癌、卵巢癌以及其 他的一些肿瘤易感的家族人群中多有BRCA1的突变。BRCA1的泛素连接酶活性与肿瘤的 发生密切相关，如乳腺癌病人家族中BRCA1在其RING结构域中发生的突变都使其失去了 泛素连接酶活性 23; 由于 BARD1 与 BRCA1 的结合可以增强其活性和稳定性 , 因此 BARD1 的缺失后会造成其泛素连接酶活性的降低， 产生和 BRCA1 缺失相类似的表型24。 并且在乳腺癌和卵巢癌病人中都有发现BARD1的突变25。3 泛素介导蛋白质降解与细胞凋亡细胞凋亡(也称细胞程序性死亡)无论是在生物正常的发育中还是在病理情况下都具有十分 重要的作用。细胞凋亡的发生途径主要有两种: 外部途径和内部途径。外部途径， 也称胞质 途径， 是通过 Fas 死亡受体引起的; 内部途径， 也称线粒体途径， 是通过刺激线粒体内部细 胞色素C( Cytochrome C)的释放引起的。3.1 泛素介导的蛋白质降解对细胞凋亡的调节1990 年， Schwartz L M 等26首次将泛素与细胞凋亡联系起来， 其研究结果表明昆虫肌节细 胞凋亡过程中泛素的表达量上升。其后的研究逐渐揭示了泛素在细胞凋亡过程中的重要作用， 在细胞凋亡的每一时期都有泛素降解途径的参与。IAP(Inhibitors of Apoptosis)家族蛋白的C端具有RING结构域，具有泛素连接酶的活性，主 要通过降解促凋亡蛋白来抑制细胞凋亡。其机制是IAPs蛋白与Caspase-3、-7和-9结合使其 失活，但IAPs蛋白抑制Caspase通过多种方式，泛素化是其中的一种机制27XIAP主要泛 素化并降解 Caspase-3 以及 SMAC(Second mitochondria derived activator of caspase),以直接 和间接的方式抑制Caspase的功能。Bcl-2 家族成员中既有促凋亡因子又有抗凋亡因子， 因此负责降解这些蛋白质的泛素化酶对 于细胞凋亡的调节也是具有两面性的，如促凋亡因子BH3-only蛋白如Bid、Bax和Bak的泛 素化可以促进细胞存活；另一方面，内皮细胞的凋亡需要Bcl-2和Bcl-x的泛素化降解28。此外，细胞凋亡还受到NF-kB、p53等信号通路的调节，而它们都同时受到泛素介导的蛋白 酶体途径的调节。3.2 细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡与肿瘤发生可以说是两个截然相反的过程， 细胞凋亡异常则会产生肿瘤， 因此， 诱 导肿瘤细胞发生凋亡是肿瘤治疗研究中的焦点。Adams J等29发现抑制蛋白酶体的活性可 以使p53、p27、促凋亡因子Bax、Bad等累积，从而激活线粒体凋亡途径。因此利用泛素蛋 白酶体抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡， 这在肿瘤的治疗具有十分重要的应用价值。IAPs蛋白在恶性肿瘤中倾向于高表达，在确诊的78名急性骨髓性白血病病人中XIAP表达 较高者的预后较差30,但有些研究则相反31。IAPs蛋白家族的另一成员Survivin的蛋白 水平在恶性肿瘤和正常组织中具有显著差异, 有趣的是 Survinin 在胞核中过表达提示肿瘤的 恶性程度较高，但胞浆中表达并非如此32Survivin基因的表达主要在胚胎期，而在成体中 表达较低，因此可被用作诊断的标志分子。目前已经开始了针对Survivin的反义核苷酸和小 分子化合物抑制剂的研究。4结语随着人们对肿瘤发生的分子机制进一步的了解 ， 泛素介导的蛋白质降解途径在肿瘤发生中 的重要性也越来越显著， 并且逐渐成为肿瘤治疗的主要靶点之一。许多研究表明， 抑制 26S 蛋白酶体的活性， 可以选择性的抑制肿瘤细胞的增殖。而且很多抑制蛋白酶体活性的药物可 以促进肿瘤细胞凋亡， 杀死细胞33， 克服抗药性34， 增强肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。Bortezomib作为26S蛋白酶体的抑制剂就是一个成功的例子，它是由一个硼酸基团连接到一 个二肽上构成的一个小分子。 Bortezomib 已经通过美国 FDA 认证用于治疗多发性骨髓瘤 35。Bortezomib对26S蛋白酶体的抑制作用有很高的选择性，其对细胞的影响是通过多个 机制实现的。它可以促使细胞发生凋亡， 抑制细胞内抗凋亡因子的表达， 提高凋亡信号的活 性等。相信随着研究的深入， 越来越多的蛋白酶体抑制剂将会用于肿瘤的治疗中。参 考 文 献 (References):1 Koepp D M， Harper J W， Elledge S J. 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