二章基因工程及其在食品科学中的应用ppt课件

制备目的基因制备目的基因构建重组构建重组DNA 获得转化体获得转化体 挑选出重组转化体阳性克隆挑选出重组转化体阳性克隆 筛目的基因在受体生物筛目的基因在受体生物细胞中高效表达隆细胞中高效表达隆 大鼠生长激素基因大鼠生长激素基因转入小鼠转入小鼠(2)限制酶的分类限制酶的分类 根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型:I型型:三种不同亚基组成；辅助因子为三种不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及及S-腺苷腺苷甲硫氨酸甲硫氨酸 其切割位点距其识别位点至少其切割位点距其识别位点至少1000bp；且切割作用是；且切割作用是随机的随机的 型型:两个一样亚基组成；辅助因子仅为两个一样亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；其识别位；其识别位点常具旋转点常具旋转 对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近；对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近；且切割作且切割作 用特异性强用特异性强 型型:两种不同亚基组成；辅助因子为两种不同亚基组成；辅助因子为ATP和和Mg2+，也受，也受S-腺苷甲硫腺苷甲硫 氨酸激活，但并非必需；其切割位点普通在距其识氨酸激活，但并非必需；其切割位点普通在距其识别位点别位点3端端 2426bp处处 PstI 5-C TGCA G-3 3-G ACGT C-5 HpaI 5-GTT AAC-3 3-CAA TTG-5 限制性内切酶的旋转对称性限制性内切酶的旋转对称性 需求指出的是，I型和型限制性内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而对型限制性内切核酸酶而言，其只具限制酶活性，与其相应的DNA甲基化酶才具甲基化酶活性。型限制性内切核酸酶及其相应的DNA甲基化酶对DNA有一样的识别序列。(3)型限制性内切核酸酶的根本特性 识别序列与切割位点 型限制性内切核酸酶可识别长度为47bp的双链DNA特定序列，该识别序列(识别位点)常呈旋转对称性 切割方式 平齐末端、5磷酸端25个核苷酸突出单链黏性末端、3-羟基端25个核苷酸突出单链黏性末端 5 33 5 5 33 55突出突出3突出突出 平端平端5 33 5型限制性内切核酸酶切割方式型限制性内切核酸酶切割方式 同裂酶与同尾酶同裂酶与同尾酶isoschizomer：在：在型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均一样者序列和切割方式均一样者 如：如：Hpa和和Msp I两者的识别序列都是两者的识别序列都是CCGG，切割方式，切割方式也一样，因此二者为同裂酶也一样，因此二者为同裂酶 isocaudamer：来源及识别序列不同，但：来源及识别序列不同，但DNA经其切割后能构经其切割后能构成一样黏性末端者成一样黏性末端者 如：如：BamH I、Bcl I、Bgl、Mbo I、Sau3A I及及Xho切割切割DNA后都构成一样的后都构成一样的GATC四核苷酸突出单链黏性末端，因此四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶其为一组同尾酶 需求指出的是，由同尾酶切割需求指出的是，由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以所得到的黏性末端可以彼此衔接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列彼此衔接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。都已不再存在。假设构成某DNA分子的碱基对总数目(B)及某限制酶识别位点核苷酸序列均为知，那么该限制酶在该DNA分子上的实际切割位点数目(N)为：N=BF 假定在某DNA分子中四种核苷酸残基数量相等，那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)4，即1256，也即平均256个碱基对出现1个切割位点。同样，识别序列为六个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)6，即14096，也即平均4096个碱基对出现1个切割位点。需求指出的是：实践情况与实际不相符(4)影响限制性核酸内切酶活性的主要要素及优化战略 底物DNA制备物的纯度：蛋白质、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。底物DNA的甲基化程度：大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种DNA甲基化酶：a、dam甲基化酶；b、dcm甲基化酶。底物DNA的构造构型：环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。因此，在用限制性酶酶解同样分子量的DNA时，环状双螺旋DNA所需酶量为线性DNA的1020倍。酶反响缓冲液的组成：酶反响的最适温度：为了提高限制酶对底物为了提高限制酶对底物DNA低纯度制备物的反响效率，普通低纯度制备物的反响效率，普通采用如下方法：采用如下方法：a 添加限制酶的用量添加限制酶的用量(平均每平均每g底物底物DNA可用可用10IU甚至更多甚至更多些些)；b 延伸酶催化反响的保温时间，使酶解更完全；延伸酶催化反响的保温时间，使酶解更完全；c 扩展酶催化反响的体积，使潜在的抑制要素被稀释，以减扩展酶催化反响的体积，使潜在的抑制要素被稀释，以减弱其抑制造用；弱其抑制造用；d 在反响液中参与适量亚精胺在反响液中参与适量亚精胺(普通运用浓度为普通运用浓度为12.5mmolL)，以利限制酶对基因组，以利限制酶对基因组DNA的酶解作用。的酶解作用。(5)限制性内切核酸酶酶解反响的操作步骤及留意要点限制性内切核酸酶酶解反响的操作步骤及留意要点(二二)DNA聚合酶聚合酶 最常用的依赖于最常用的依赖于DNA的的DNA聚合酶有大肠杆菌聚合酶有大肠杆菌DNA聚聚合酶合酶I(全酶全酶)、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段(Klenow片段片段)、T4噬菌体编码的噬菌体编码的DNA聚合酶、耐热的聚合酶、耐热的DNA聚合酶聚合酶(TaqDNA聚合酶聚合酶)等等 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶，即逆转录酶，优先以聚合酶，即逆转录酶，优先以RNA为模板，也可以为模板，也可以DNA为模板，因此该聚合酶能以为模板，因此该聚合酶能以RNA为模板为模板催化合成双链催化合成双链DNA DNA 聚合酶聚合酶Klenow 酶的作用方式酶的作用方式