固体支撑脂质双层膜与蛋白的相互作用

固体支撑脂质双层膜与蛋白的相互作用固体支撑脂质双层膜与蛋白的相互作用 2016/07/27 光散射学报2017年第2期摘要：固体支撑脂质双层膜能很好的模拟生物膜系统，固体衬底的表面结构和性质会影响双层膜的成膜过程、流动性、微区形成以及化学活性，进而影响蛋白的特性。本文，我们在两种衬底云母和二氧化硅表面，构建了包含神经节苷脂的固体支撑脂质双层膜，用拉曼光谱研究了两种衬底表面脂质膜的分子构象。并且，在脂质膜表面加入淀粉样蛋白，分析两种衬底上淀粉样蛋白的构象差异。关键词：固体支撑脂质双层膜；蛋白；拉曼光谱；云母；二氧化硅引言神经节甘脂（）对于许多神经系统中的细胞功能都有重要价值，如信号转导、神经元分化和轴突、树突和突触的形成。由酰基链和一个复杂的头基端组成。研究表明，会与淀粉样（）蛋白形成种子，可以促进蛋白的构象转变，从无规卷曲到和结构，导致蛋白形成寡聚体和纤维化，并且具有毒性。这种具有毒性的蛋白在阿尔茨海默症（）中会引起神经元细胞的死亡。固体支撑脂质双层膜（）是很好的模拟生物膜系统，但固体衬底的表面结构和性质会影响双层膜的成膜过程、流动性、微区形成以及化学活性。不同衬底上的脂质膜对蛋白构象的影响有很大差异，特别是含有的脂质体双分子层。有报道研究了云母和二氧化硅（）表面包含的脂质膜与蛋白的相互作用。该研究通过原子力显微镜（）观察，在云母和表面的构象有所差异，并且，在同等条件下云母表面蛋白聚集和纤维化的速度要大于表面的。拉曼光谱可以提供有效的分子结构信息。因为液体环境下水的拉曼散射比较弱，所以用拉曼光谱研究液体环境下的分子结构更方便。但是拉曼散射效应是很弱的，很容易被溶剂的荧光淹没。最近，拉曼光谱在解决生物问题方面得到广泛关注，已经被成功运用于检测细胞成分和代谢活动。但是，因为脂质双层膜的厚度只有，所以拉曼光谱很难被探测到。因此，一种复杂的结合拉曼光谱仪，显微镜和共聚焦系统的拉曼光谱系统被研发，该系统可以提高分辨率和信号采集效率，从而，可用于研究脂质膜的拉曼光谱。本文主要运用拉曼光谱对比分析了两种衬底云母和表面的的分子构象，以及加入蛋白后构象变化的差异，从分子水平分析了衬底材料对脂质双层膜构象的影响，以及对蛋白聚集速率的影响。实验方法材料和试剂单唾液酸四己糖神经节苷脂（），胆固醇（）和（）购买自公司，鞘磷脂（）和鞘磷脂（）购买自公司，其它试剂均为国产分析纯。亲水性基底的处理亲水性基底是通过对（）做湿氧化处理得到的，将（）经过一系列处理：（）（容量比），（），进而（）（）。，单体（）溶液的制备、和的摩尔比例为和。首先，取适量的，和分别溶于氯仿甲醇（，）混合溶液中，利用氮气使溶液蒸发，并在真空干燥箱中放置整夜，以形成干燥的膜，将干燥的混合磷脂溶于超纯水中，达到最终浓度。将该混合溶液进行冷冻融化三次，后在下超声，最终得到磷脂囊泡溶液（）。制备用于观察荧光的时，需要用对进行荧光标记，的浓度为（）。制备好后，取!溶液滴到直径的新鲜固体衬底表面，在室温下放置分钟，放置分钟后冷却到室温。最后，用超纯水清洗四遍移除未破裂的囊泡，所有的样品都是在聚四氟乙烯的样品池里制备。将（）蛋白溶于的氨水溶液中，将溶液在，下离心（），得到单体的（）蛋白，浓度为!，在下分装储存。使用时，将（）溶液用缓冲液稀释至!。荧光显微镜和拉曼光谱仪表面形貌的荧光图像是在荧光显微镜（）上观察，经（）处理得到的。拉曼光谱是在上测得，激发光源是，光谱范围是，累计时间是，物镜放大倍数为，光源功率低于，从而避免激光对样品造成破坏。结果和讨论在云母和上的表面形貌我们用比例为的溶液通过囊泡融合法在云母和表面形成平坦的。为了确认形成了磷脂膜双层的膜，我们用荧光显微镜对其形貌进行观察。图是云母和表面形成的的一系列荧光漂白恢复图像（），为云母表面的图像，为表面的图像，进行漂白后荧光还能恢复是因为的横向扩散。可以看到在表面和云母表面都形成了非常平坦完整的，未破裂的囊泡量很少。如图所示，两种基底上的都能实现荧光恢复。表明在两种衬底表面，都处于液相状态。这是因为液相状态的扩散系数比凝胶状态大几个数量级，液相的荧光恢复时间比凝胶状态快得多。但是在时和时云母表面比表面荧光恢复较快，表明云母表面的流动性更好。在云母和上的拉曼光谱在云母和表面形成（）后，直接对其进行拉曼测试。图是云母和表面的的拉曼光谱，光谱为云母表面的，为表面。表给出了拉曼光谱的峰值频率和归属。振动（），如图所示，光谱和的伸缩振动区域都相应出现了几个峰，这个区域有利于观察磷脂双层膜中酰基链的变化。对于酰基链的拉曼振动，已经通过对磷脂膜的简正坐标分析和推论进行过研究。振动对亚甲基链的的偏转和全反式构象很敏感，并且受亚甲基旋转和变形影响很小。如果酰基链是全反式链，拉曼光谱将会出现（反对称伸缩）和（对称伸缩）两个峰。而谱带归属于有偏转缺陷的全反式，光谱，中这个峰的出现表明在云母和基底表面形成的具有偏转构象，而不是“全反式”。在光谱图光谱中，来自于中乙酰神经氨酸（）的振动。是含有唾液酸的糖脂，而是唾液酸的主要形式，在的头端有结构。而在光谱中，因为在处有很强的特征峰，从而将的特征峰遮盖，无法观测到的特征振动。我们在图中列出了云母和的拉曼光谱，其中图对应于云母的拉曼峰，图对应于。对于图光谱的特征峰，它既来自于磷脂分子振动，也有来自云母基底的贡献。因为云母在有丰富的振动峰（图），在这个区域，我们也无法分析的构象信息。另外，基底在和都有很强烈的特征峰（图），将在该部分的分子振动特征掩盖。因此，在表面的拉曼谱之前的区域，我们也无法分析的构象。扭转摇摆弯曲（）。这个区域来自于的扭动摇摆弯曲模式。在图中，来自于的扭转，来自于的摇摆。另外，弯曲的拉曼特征在光谱和中分别出现在和，这两个峰只在六方晶相结构中出现，表明磷脂分子是晶体结构。并且，这个区域受分子内和分子间费米共振相互作用。对全反式酰基链的相关研究表明，摇摆的基本面（）和未受扰动的弯曲的基本面（）之间的费米共振，会在处产生一个很强的，在有一个弱的拉曼峰。然而，如果酰基链是单斜或斜方晶系，在处还会出现拉曼峰。因此，从的拉曼特征振动可知在云母和表面形成的（）都处于六方晶相。和伸缩区域（）。和伸缩振动的拉曼特征都出现在。如图所示，谱带（光谱）和（光谱）来自于（）振动，（光谱）和（光谱）与（）相关，这两个谱带在光谱和中几乎相同。另外，光谱中，亚甲基的对称和不对称伸缩出现在和，光谱中出现在和。从拉曼谱带强度得出的参数可以用于估计脂质双层的分子间相互作用，和的峰强比，表示为，反应了链间横向相互作用，。光谱中比值比光谱中略大，这表明表面的横向链间相互作用比云母表面的略大，流动性较小，这与结果相一致。云母和上加入（）后的拉曼光谱为了研究不同基底材料对（）和相互作用的影响，我们在云母和上形成后，直接在其表面加入!的单体（）溶液，（）的最终浓度为!，将样品池下恒温放置，之后进行拉曼测试。如图所示，光谱代表云母表面的拉曼光谱，光谱代表表面的拉曼光谱，图是区域的拉曼光谱，图对应于区域。如图光谱所示，相比于云母上的的拉曼谱（图光谱），加入（）后，的拉曼光谱几乎消失，我们将这个变化归因氨基酸和头端的可能发生了直接相互作用。另外光谱和都出现了新的峰，它对应于（）蛋白的螺旋结构。这个峰的出现表明，此时在两种基底上（）都发生了无规卷曲结构到螺旋结构的转变。另外，光谱中，发生轻微偏移至，它既代表磷脂分子摆动，又与多肽的结构有关（的出现与折叠结构相关）。在出现新的谱带，可以归属于（）的酪氨酸残基。这两个峰的变化在光谱中都没有表现。光谱和的差别表明，在两种基底上，（）都表现出了螺旋结构，云母表面（）已经聚集并出现了折叠结构和氨基酸残基的信号峰，而在表面却还没有表现出来。从图中光谱区域分析发现，在云母表面的拉曼光谱发生了很大变化，而在表面这个区域的拉曼峰与图中几乎一样。与图中云母表面（光谱）相比，偏移至和，比值变大。这说明，加入（）后，的链间横向相互作用变大，趋向于凝胶状态。另外，来自于（）的偏移至并且峰强明显变大。（）减弱几乎消失，（）增强很多，这两个峰属于疏水部分的甲基头端。这些变化表明在云母表面（）与疏水端的相互作用，疏水链包含酰基链和甲基头端。而在表面（）与相互作用速度较慢，此时（）没有进入到疏水部分。随着（）加入时间增加，拉曼光谱继续发生变化，图表示的是在表面加入（）后的拉曼光谱。光谱为云母表面的拉曼光谱，光谱代表表面的拉曼光谱。图是区域的拉曼光谱，图是区域的拉曼光谱。在云母表面，与的拉曼光谱相比，的光谱又有几个新的峰出现，和。其中，处窄的强的谱带来自于（）的苯丙氨酸，和可以归属于（）的酪氨酸。这几个来自氨基酸残基的拉曼特征峰在光谱中都没有出现。我们可以将这两种氨基酸强度的增加归因于随着蛋白加入时间增加，说明（）在云母表面比在表面聚集更多。光谱中，（）的拉曼信号出现在，光谱中在，对应于的折叠结构。与此同时，光谱中代表的螺旋结构出现在，光谱中出现在处。光谱中表示扭转的比图中强度更强，这可能是因为（）对酰基链的亚甲基产生了影响。（）的（）在的强度明显增强，那是因为（）蛋白发生了更多的聚集和构象转变。在光谱中，强度增加幅度较小。说明表面（）聚集程度比云母上小。对于区域（图），与图中相比，振动强度整体增强幅度较大，偏移至和，并且比图中大。且和明显增强。这说明随着（）加入更长时间，云母表面聚集更多（），并且蛋白与疏水端作用更强烈，趋向于凝胶状态，膜在一定程度被破坏。而光谱中无论是峰强及峰位变化都较小。表明在表面（）聚集以及与疏水端的相互作用程度比较弱。从上述结果可以看到，由于衬底的作用，导致表面上形成的脂质双层膜的流动性较小，横向链间相互作用较大。另外是含有唾液酸的糖脂，是唾液酸的主要形式，它的特征峰只出现在云母衬底上，并且在加入后这个特征峰的消失表明与蛋白的直接相互作用。这些证明了在云母上的功能团很可能是暴露在上面的，而且由于较好的流动性很可能使得聚集形成了团簇。暴露在表面的聚集的通过发生相互作用绑定，但是在衬底上团簇的形成较为困难，也可能不是暴露在膜表面的，所以对的绑定相对较少。这从酪氨酸和苯丙氨酸的特征振动没有出现，而且螺旋结构和折叠结构的特征振动峰相对较弱也可以证明，说明（）在表面比在云母表面聚集的少，使构象转变相对较慢。另外在表面脂质双层膜疏水端的变化也比较缓慢，而云母表面随着（）加入更长时间，蛋白与疏水端作用强烈，趋向于凝胶状态，膜在一定程度上被破坏。（）与相互作用是通过疏水性终端插入双层膜中与脂质体的疏水性酰基链相互作用，很可能因为表面有较大的横向相互作用，终端的插入相对比较困难，所以衬底上的疏水端在蛋白的作用下基本上没有变化。结论，和是等离子膜脂筏的主要成分，这些脂筏被对信息传导，细胞运输脂质排序起到重要作用，经常作为细胞膜模拟体系用于研究。固体支撑脂质双层膜是很好的模拟生物膜系统，但固体衬底的表面结构和性质会影响脂质膜的成膜过程、流动性、微区形成以及化学活性。在本论文中，利用囊泡融合法在云母和表面都形成了平坦均匀的，通过拉曼光谱分析云母表面的流动性比表面要好，从分子水平上分析了基底材料对磷脂分子构象的影响。加入蛋白后，不同时间的拉曼光谱表明基底材料对蛋白构象变化有所影响。蛋白在表面比在云母表面聚集的少，使蛋白构象转变相对较慢。在表面，蛋白与脂质双层膜疏水端作用比较缓慢。而在云母表面，随着加入的增加，蛋白与疏水端相互作用比强烈。