流式细胞术详解

流式细胞术详解一. 流式细胞术概述流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是七十年代发展起来的高科学技术，它集计算机技术、激光技术、 流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗 粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行 分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集（分选） 某一亚群细胞，分选纯度95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司 （简称B-D公司）。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D 公司最新产品为 FACS Vantage和 FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL 和 FACS Calibur 是临床型;EPICS ALTRA 和FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，多用于科学研究。二. 流式细胞仪主要技术指标1流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测10005000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。2流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子,两个细胞间的荧光差5%即 可区分。3前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测 量到 0.2pm0 .5pm。4流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到2.0%，这也是测量标 本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。5流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。三. 流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统流式细胞仪主要由以下五部分构成:流动室及液流驱动系统激光光源及光束形成系统光学系统信号检测与存储、显示、分析系统细胞分选系统。流动室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在 细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相 交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液 流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管 压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60pm、100pm、150pm、 250pm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide)四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488nm, 此外可配备氦氖离子气体激光管(波长633nm )和/或紫外激光管。流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关， 激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光 源。在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截 面较小的椭圆形激光光束(22pmx66pm),在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测 区的细胞受照强度一致。五. 流式细胞仪主要构造和工作原理 光学系统流式细胞仪的光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流 动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔(一般为2片透镜、 1 个小孔)的主要作用是将激光光 源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过 激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰；流动室后的光学系统主要由多组滤光片 组成，滤光片的主要作用是将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管。滤光片主要有三类：长通滤片(LP)-只允许特定波长以上的光线通过，短通滤片(SP)-只允许特定波长以下的光线通过，带通滤片（BP）- 只允许特定波长的光线通过，不同组合的滤片可以将不同波长的荧光信号送到不同的光电倍增管（PMT）,如接收绿色荧光（FITC）的PMT前面配置的滤光片是LP550和BP525,接收色橙红色荧光（PE）的PMT前面配置的滤光片是LP600和BP575,接收红色荧光（CY5）的PMT前面配置的滤光片是LP650和BP675。见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。六. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号检测系统当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分 为前向角散射（Forward Scatter, FS）和侧向角散射或900散射（Side Scatter, SS），散射光是细胞的物理 参数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞 样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光,荧光信号较强, 这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自 发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。前向角散射（FS）反映被测细胞的大小，它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧 向角散射或900散射（SS）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状,它由一 个光电倍增管（PMT）接收并转变为电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长（如氩离子气体激光管,它的发射光波488nm,氦氖离 子气体激光管发射光波长633nm）。488nm激光光源常用的荧光染料有FITC （异硫氰酸荧光素）、PE （藻 红蛋白）、PI （碘化丙啶）、CY5 （化青素）、preCP（叶绿素蛋白）、ECD（藻红蛋白-得克萨斯红）等。他们的 激发光和发射光波长分别是：激发光波长（nm）发射光峰值（nm）FITC488525（绿）PE488575（橙红）PI488630（橙红）ECD488610（红）CY5488675（深红）PreCP488675（深红）各种荧光信号由各自的光电倍增管（PMT）接收并转变为电信号后存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内.见图12.2光学系统和信号检测系统示意图。七. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号存储、显示、分析系统（一） 信号存储存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内的数据一般是以List mode（列表排队）方式存入的，采用List mode 方式有两大优点:节约内存和磁盘空间易于加工处理分析。（二）信号显示和分析由于List mode方式数据缺乏直观性，数据的显示和分析一般采用一维直 方图（图12.3）、二维点阵图（图12.4,12.5）、等高线图（图12.8）和密度图（图 12.7）。1单参数数据显示和分析 细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显 示，图中横坐标表示散射光 或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的；纵坐标表示细胞数。见图12.3 一维直方图，图中横坐标是 FITC 荧光信号相对强度值（对数），纵坐标表示细胞数;图中已根据阴性对照设 定适当的“门”（直线门），仪器的计算机就会给出测定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）。2.双参数数据显示和分析 细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系用一维直方图、二维点阵图、等高 线图和密度图显示和分析。如图12.4二维点阵图，是正常人外周血白细胞的前向散射光（FS）和侧向散 射光（SS）组成的点阵图，横坐标和纵坐标均是线性的，图中淋巴细胞、单核细胞、粒细胞很明显地分为 3群，可以很容易地圈“门”（Bitmap，无定型门），分析各亚群细胞的数据;图12.6假三维地形图（X轴：SSC ,Y 轴:FSC Z轴:细胞数）更清楚地表明这一点。图12.5二维点阵图是细胞的两种荧光（FITC和RD1）双参数 数据显示，横坐标和纵坐标均是对数的，横坐标代表FITC，纵坐标代表PE,图中已设定适当的“门”（十 字门），十字门的D1、D2、D3、D4门分别代表PE单阳性细胞、PE和FITC双阳性细胞、阴性细胞、FITC 单阳性细胞。仪器的计算机就会给出两种荧光测定值（包括阴性细胞%、两种荧光各自的阳性细胞%、两 种荧光的双阳性细胞%、各群细胞的平均荧光强度）。图 12.7和图 12.8分别是测定细胞的两种荧光双参数 数据的密度图和等高线图，横坐标和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定十字门就可得到两种荧 光的各种测定值，密度图和等高线图较点阵图更直观。3三参数数据显示和分析 细胞的三参数测量数据和细胞数量的关系每两个数据组成一对（三参数测量 数据和细胞数量每两个数据可组成6对数据）用一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。 三个荧光数据关系用分光图（prism，表示，分光图可直接给出8个数据（如用ABC代表3种荧光，可有 A+B+C+、A+B+C-、A+B-C-、A-B+C+、A-B+C-、A-B-C+、A+B-C+、A-B-C-）。见图 12.9 prism，图 12.9为人外周血淋巴细胞亚群测定结果的分光图，图中给出CD3、CD4、CD8组合的各种结果，如T辅助细胞(CD3+CD4+CD8-)为 42.0%,如 T 抑制细胞(CD3+CD4+CD8-)为 17.4%。图12.5两种荧光的二维点阵图(采自Coulter Operaters Guide)图 12.7. 双参数数据的密度图(采自 Coulter Operaters Guide)图 12.6假三维地形图和二维点阵图(采自 Coulter Operaters Guide)图12.8双参数数据的等高线图(采自 Coulter Operaters Guide)图12.9分光图(prism)八. 流式细胞仪主要构造和工作原理 细胞分选系统如在细胞流动室上装有超声压电晶体,通电后超声压电晶体发生高频震动，可带动细胞流动室高频震动，使细胞流动室喷咀流出的液流束断成一连串均匀的液滴，每秒钟形成液滴上万个。每个液滴中包含着一 个样品细胞，液滴中的细胞在形成液滴前已被测量,如符合预定要求则可被充电，在通过偏转板的高压静电 场时向左或向右偏转被收集在指定容器中，不含细胞液滴或细胞不符合预定要求液滴不被充电亦不发生偏 转进入中间废液收集器中,从而实现了分选。 分选的详细原理和操作请有兴趣者参考有关文献。九. 流式细胞术在血液学中的应用 DNA 倍体分析及细胞周期分析在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化，正常情况下，大多数细胞处于休止期(Go), G1期 细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N,为二倍体细胞，处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA 含量为2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N)。细胞经固定后用PI(Propidium Iodine碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定。但标本需先经RNA酶处理以排除RNA 干扰。FCM可在测量大量细胞(数分钟可测定105个细胞)后给出DNA分布直方图，见图12.10.正常人外周 血DNA示意图，图中第一个峰(G1)是DNA含量为2N的细胞峰，第二个峰是DNA含量为4N的细胞峰, 两峰之间是DNA含量为2N-4N的处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞。用厂家提供的Multicycle软件, 计算机可自动计算出G1%、S+G2M%;如用DNA/RNA双参数分析，可得到G0:G1%,G0/G1期DNA指 数,如标本中有凋亡细胞，在G1峰前会出现一个亚G1期峰,软件可自动计算出凋亡细胞的。图12.10.正常人外周血DNA示意图(采自Coulter Training Guide)DNA倍体分析的临床有价值的指标是DNA非整倍体和/或超二倍体和四倍体增高。这些改变是肿瘤细 胞的特异性改变，和实体瘤相比，急性白血病非整倍体发生率较低，约3040%。十. 流式细胞术在血液学中的应用 淋巴细胞亚群测定淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞(CD3+), T辅助细胞(CD3+CD4+), T抑制细胞(CD3+CD8+), B 淋巴细胞(CD19+或 CD20+), NK 细胞(CD3-CD56+)等。常用来测定淋巴细胞亚群的单克隆抗体(Monoclonal Antibody McAb)都是小鼠抗人lg,有精制抗体,有直标 荧光抗体，现在一些国外公司有双色和三色McAb出售，如CD4-FITC/CD8-RD1、CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等，此时应根据这些双色或三色McAb的Ig性质选择相应的阴性对照，如 MslgG1-RD1/MslgG2-FITC等。上机测定时应先测定阴性对照管，阴性对照的阳性细胞应2.0% 三色测定可给出更为准确的各亚群的情况:如真正的T辅助细胞应是CD3+CD4+CD8-,真正的T抑制细胞 应是CD3+CD4-CD8+,单标CD8+细胞中不仅有T抑制细胞,还含有30%左右的NK细胞;而CD3+CD4-CD8-细胞群是丫打细胞，此类细胞与感染有关，CD3+CD4+CD8-细胞+CD3+CD4-CD8+细胞 +CD3+CD4-CD8-细胞+CD3+CD4+CD8+细胞=CD3+细胞。如单标记CD56不能准确测定NK细胞,NK细 胞应是(CD3-CD56+)，因为CD56+细胞中包含着非HLA束缚细胞毒T细胞(CD3+CD56+)。双色组合还能 测定B淋巴细胞(CD3-CD19+或CD20+)、激活的T细胞(CD3+CD69+或CD3+25+)等。应用适当的双色组合如CD4与CD29,CD4与CD45RA,可以测定T辅助细胞的的亚群。如CD4+2H4(CD45RA)+细胞是Ts的诱导细胞;CD4+4B4(CD29)+细胞Th的诱导细胞。 同理，利用 CD8+CD45RA和CD8+CD29+S6F1可测定T抑制细胞的亚群。T辅助细胞还可分成Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子IFN-y和IL-4，可区分Th1细胞(CD4+/ IFN-Y+) 和 Th2 细胞(CD4+/IL-4+)。利用CD25、CD69等McAb和其他淋巴细胞标记双色或三色标记还可测定淋巴细胞亚群的功能状态，如 活化T8、活化B细胞等。以下给出常用细胞亚群的正常范围供参考，请注意同一 CD中有多种克隆的McAb,同一 CD中不同McAb所测出的数值不同，每个实验室应测定自己实验室的正常数值。CD3+70.012.0%+4B4+23.07.0%CD3+CD4+CD8- 40.09.0%CD4+2H4+19.06.0%CD3+CD4-CD8+ 30.08.0%CD3-CD56+(NK)12.08.0%十一. 流式细胞术在血液学中的应用 白血病免疫分型原理白血病免疫学分型是利用单克隆抗体(McAb)检测白血病细胞的细胞膜和细胞浆抗原,分析其表现型，以 了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。对白血病细胞抗原的分析研究有助于对白血病分型，为诊 断和治疗提供依据。白血病免疫分型是形态学分型的重要补充和进一步深化，国际MIC分型协作组认为每 一例急性白血病的免疫分型都是必不可少的。白血病免疫分型对鉴别急淋和急非淋有决定作用，对鉴别急 非淋的某些亚型如 M7、M3 也有决定作用，对于一些用形态学、细胞组织化学不能诊断的急性白血病，急 性未分化白血病，混杂性白血病等有重要意义。自从单克隆抗体问世以来,最成功的应用就是研究造血系统 各类细胞表面抗原与细胞增殖、分化及恶变的关系。研究发现细胞表面抗原有重要功能,一些抗原分子作为 细胞生长因子的受体而影响细胞的增殖分化;一些抗原分子作为细胞间相互识别的物质基础而参与细胞间 相互作用;一些抗原分子则是细胞特异功能的物质基础。从多能造血干细胞（PHSC）分化成熟为功能细胞过程中，细胞表面和细胞浆内抗原随着分化成熟过程不断 发生改变，这些抗原称为造血细胞分化抗原。造血细胞分化抗原是造血细胞分化过程中由细胞核内染色体 上的基因编码的镶嵌蛋白，其出现、增多、减少或消失与造血细胞分化密切相而表现出与细胞系列及分化 程度相关的特异性。 这些抗原可作为鉴别和分类造血细胞的标记。如髓系细胞的 MPO、 CD33、 CD13、 CD14、CD15 等抗原；巨核系的 CD41、CD41、CD61 抗原；T 淋巴细胞的 CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、 CD8等抗原;B淋巴细胞的CD19、CD20、CD22等抗原。至今尚未发现白血病细胞特异性抗原，而白血病 细胞是造血细胞在某一分化阶段的大量积累,表达与之相应的造血细胞分化抗原，因此可用造血细胞分化抗 原类标记检测白血病细胞；但白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相 同。常有丢失某一分化发育阶段正常应有的抗原,或表达某一分化发育阶段正常不应有的抗原，或表达其他 系列抗原，部分丧失了系列专一性和分化的严格性。用FCM检测白血病免疫分型具有快速、简便、重复性好等优点。由于FCM可根据FSCvSSC直方图区分 细胞并可圈定检测细胞范围（Bitmap,无定型门），或用SSC（线性或对数）和CD45直方图圈定检测细胞范围 但itmap，无定型门），排除其他细胞干扰，因此较光学显微镜免疫荧光法或免疫组化法结果更准确。十二. 流式细胞术在血液学中的应用 白血病免疫分型其临床意义目前公认的系列特异性指标是:T淋巴细胞系-胞浆CD3 （cCD3） ,B淋巴细胞系-cCD22或cCD79， 髓系MPO或cCD13,一般可先用他们区分细胞系列后再进一步分析某一系列亚型和分化阶段。1. ALL 的免疫学分型1986年前分为普通型ALL （CALL）、未分化细胞ALL （Null-ALL）、T细胞ALL（ T-ALL）、前B细胞 ALL （PreB-ALL）、B细胞ALL（B-ALL）五型;1986-1994年分为两大类九型（非T-ALL六型,T-ALL三型）, 九十年代后期有人按临床实用性一般分为B祖细胞ALL、前B细胞ALL、B细胞ALL、T细胞ALL四型。 表12.1-表12.4列出ALL的五型、九型（B细胞系列六型、T细胞系列三型）、四型分类法。B-祖细胞ALL :B-祖细胞ALL占儿童ALL的65%-70%,青少年ALL的55%-60%，成人ALL的50%，儿童 ALL 90%病例CD10+，而婴儿CD10+病例50%。FAB分类为L1、L2，白血病细胞的FS和SS都很低; 一般TdT、HLA-DR、CD19阳性，大多数病例CD24、CD34阳性，本型细胞膜免疫球蛋白（lg）阴性。此 型有CD10+、CD10-两个亚型，CD10+型预后较CD10-型好。前B细胞ALL :前B细胞ALL在发育阶段上较B祖细胞ALL晚，占儿童ALL的25%，在成人ALL占的 比例还不清楚。一般CD24、HLA-DR、CD19、CD10、cCD22阳性，CD34阴性，鉴别特点时有胞浆重链 P。此型预后较B祖细胞ALL差，可能与t(1;19)有关，t(1;19)占前B细胞ALL的25%，此型CD34-，而 B系列ALL中CD34-是独立的预后不良标记。B细胞ALL : B细胞ALL占所有ALL的2%-5%； B细胞ALL更为成熟，白血病细胞的FS和SS较B-祖 细胞ALL明显增加，在FSvSS直方图或SS(线性或对数)vCD45直方图中处于淋巴细胞和单核细胞区域。 典型标记是细胞膜免疫球蛋白(sig)阳性，表型一般为CD19、CD20、CD22、CD24阳性，多数病例CD10+， 但sig和成熟抗原出现可区别于更早的B系ALL。此型FAB分类一般为L3,罕见病例有B细胞ALL标记而 FAB分类一般为L1,这些病人多有t(1;19)和t(14;18)。T细胞ALL : T细胞ALL占儿童ALL的15%，成人ALL的25%。多数表型为胸腺细胞型，最常见的是晚期 胸腺皮质细胞亚型，CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+，CD3表达较少，TdT常阳性；另一常见 亚型是早期胸腺皮质细胞亚型，CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。髓质期亚型较少见，CD2+、CD5+、CD7+， CD3+CD4+或CD3+CD8+，TdT表达较少。前T细胞亚型，仅有CD7和cCD3而无其他T系抗原表达， 预后较差。T系肿瘤性疾病多有特异性正常抗原表达的下调或表达该分化阶段正常不应出现的抗原。成人T 细胞ALL预后较好，而儿童T细胞ALL较儿童B-祖细胞ALL和前B细胞ALL预后差，虽然各亚类预后仍 不甚明确，但CD10阴性者预后不良。ALL的免疫学分型经过1986年前分为五型，1986-1994年分为两大类九型,九十年代后期(1997)分为四 型的过程。 1986 年前的五型，是当时单克隆抗体和检测手段的反映；随着新的单克隆抗体(主要是 T、 B 淋巴细胞亚群的McAb)的发现和临床大量病例的检测，不仅弄清了 T、B淋巴细胞的来源、分化发育过程， 而且使免疫分型更加细致，因而出现了1986-1994年分为两大类九型；但按照细胞的分化发育阶段分型的 两大类九型分型法对临床略显繁琐，指导治疗、判断预后临床实用性也不够强，因此又出现了以上简单的 四型分类法。经过对比不难看出，四型分类法的B-祖细胞ALL型实际上包含了两大类九型分类法的非T-ALL 的II、III、IV 3个亚型，而V型即是前B细胞ALL型，型是B细胞ALL型；而T细胞ALL型是两大类 九型中T-ALL的三型合并为一型。两大类九型分类法的非T-ALL的I型分类为急性未分化白血病(见后)。 ALL也可按DNA含量分类，用流式细胞仪很容易测定DNA含量，DNA含量分为两个亚类：超二倍体和亚 二倍体，前者预后好，后者预后差。2急性髓细胞白血病(AML)攪 目前所有粒、单核系的单克隆抗体基本无分化发育阶段特异性，因此 AML 的免疫学分型 FAB- M0、 M1、M2界限不十分明显;但M3多不表达HLA-DR和CD34，常表达CD13、CD33、CD9、CD38； GPA在鉴 别红白血病(M6)时可提供帮助;巨核细胞白血病(M7)则有CD41、CD42、CD61为系列特异标记，为确诊的 重要指标。由于白血病的异质性，同一 FAB分类的白血病抗原表达并不完全相同。AML的免疫表型见表 12.5。MO： M0白血病细胞的FS和SS都很低，在SSVCD45直方图中处于原始淋巴细胞区域。M0的白血病细 胞至少表达一个髓系特异性标记如MPO、CD13、CD116，MPO较CD13、CD116更敏感；一般淋巴系 标记是阴性的，但可能表达CD7或CD4； 一般CD34、HLA-DR阳性。有研究显示AML复合表达CD7 和 CD34 预后不良。M1： M1的白血病细胞抗原表达类似于M0并与M0不好区分，M1 般表达CD13，CD33和HLA-DR, CD34表达较M0少，部分可能表达CD15，较少病人可能表达CD4。M2： M2与M1的主要区别是分化成熟增加，原始细胞减少；CD34表达较M1 少, CD15表达较M1增加， 大部分病例HLA-DR阳性，CD13表达强于CD33；部分M2表达CD19和CD56伴有t(8;21),罕见的伴 有t(8;21)的M2不表达CD13，CD33和CD14但MPO阳性。M3： M3白血病细胞由于它的高颗粒性而SS增大；M3的白血病细胞一般表达CD13, CD33,部分病人 可能表达CD2,但HLA-DR阴性，CD34 一般为阴性，复发病人阳性；部分病人可能表达CD56,表达CD56 者应作基因检查(APL/RARa)以排外髓/NK细胞急性白血病(详见后)。M4、M5： M4、M5的免疫表型相似，重要表型特点是表达CD13、CD33、CD14、CD15和HLA-DR,部 分病人表达CD4、CD7,部分病人可能表达CD56,表达CD2多为M4E0,常伴有16号染色体异常，预后 好。M6： M6较少见，一般表达HLA-DR、CD34、CD13、CD33, GPA对确定红系有用。M7： M7占成人ANLL的1%、儿童的4%。成人M7多见于二次性白血病，即CML.BC或MDS-RAEB或MF 白血病变。而儿童 M7 多为原发。M7 免疫学表型一般 为:CD41+,CD42+,CD61+,CD33+/-,CD13+/-,CD34+,DR+/-,CD10-。特异性标记 CD41、CD42、CD61 阳 性可确诊M7,但要注意排外血小板粘附于细胞上的假阳性结果。3急性未分化白血病 用流式细胞仪分析仅有大约 1%的急性白血病不能分类，典型急性未分化白血病仅 有HLA-DR和CD34表达而无系列特异性抗原表达。4 杂 合 型 白 血 病 真 正 的 双 系 列 表 型 白 血 病 是 伴 有 t(9;22) 或 有 11q23 MLL (myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia 髓/淋系或混合性白血病)基因重排的病人，以往报道的许 多杂合型白血病多是由于方法学问题不能排除非白血病细胞的干扰，或将非特异弱表达当作特异表达，如 前所述白血病细胞毕竟不是正常造血细胞,其抗原表达与正常造血细胞并不完全相同，部分丧失了系列专一 性和分化的严格性，因此不要轻易定型杂合型白血病，国际上杂合型白血病尚无统一诊断标准。5慢性粒细胞白血病急性变（CML BC）慢性粒细胞白血病（慢粒CML）是一种多能造血干细胞疾病，其转归 多为急性变。慢粒急变（CML BC）涉及所有造血细胞系列,往往不易从形态学上确定急变类型,50%-60%为 AML变,30%左右为ALL变。AML变可表达AML的所有表型，大多数ALL变为B细胞来源，其中cALL 及前B-ALL多见，罕见T-ALL变。6 B淋巴系细胞增殖性疾病 B淋巴系细胞增殖性疾病的免疫学分型见表12.6。采自C.D Jennings and K A.Foon 略 加 改 变 . MCL: mantle cell 淋 巴 瘤；FCCL:Follicular center cell lymphoma-泸泡中心细胞淋巴瘤；MZL: Marginal zone lymphoma边缘 区淋巴瘤; SLL:small cell lymphocyte lymphoma-小细胞淋巴细胞淋巴瘤B淋巴系细胞增殖性疾病中包括B慢性淋巴细胞白血病（B-CLL）、B幼淋细胞白血病（B-PLL）、毛细胞 白血病（HCL）和多发性骨髓瘤（MM） /浆细胞白血病和部分淋巴瘤，淋巴瘤免疫分型将在不同章节中描 述。B-CLL： B-CLL的白血病细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79a, CD5与以上抗原复合表达，slgM、 slgD、CD11c和CD25也常表达但表达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。B-PLL :流式细胞仪在区分B-PLL和B-CLL中十分有用，B-PLL通常sIg表达强，CD5阴性而CD22阳性, 困难的是原发B-PLL和由B-CLL转化为B-PLL的区分，由B-CLL转化来的B-PLL CD5阳性而CD22表达 弱,类似于B-CLL。HCL： HCL 一般表达成熟 B 细胞标记:CD20、CD22、CD19、CD79、sIg，CD11c、CD22 高表达，CD25 中等度以上表达，一般CD21-，典型病例CD5-、CD10-、CD23-，但有少数病例可阳性。CD103是HCL 最可信的标记，可用来与其它B细胞白血病鉴别。浆细胞瘤：由于大多数多发性骨髓瘤病人骨髓标本中含骨髓瘤细胞少及瘤细胞丧失了大多数B细胞系特异 性标记，用流式细胞仪分析多发性骨髓瘤（MM） /浆细胞白血病较为困难，典型的浆细胞CD38强表达而 CD45弱表达。一般浆细胞sIg弱表达,cIg阳性。7. T淋巴系细胞增殖性疾病T淋巴系细胞增殖性疾病的免疫学分型见表12.7。T淋巴系细胞增殖性疾病中包括T幼淋细胞白血病（T-PLL）、NK细胞白血病（T-LGL、NK-LGL）和成人 T淋巴细胞白血病（ATL）、T慢性淋巴细胞白血病（T-CLL）。T-PLL : T-PLL的白血病细胞一般表达 CD2、CD3、CD5和CD7，大多数病人 CD4+ CD8-，但偶有 CD4+ CD8+，单独表达CD8者少见，本病常伴有14q11和14q32改变，有CD4+ CD8-表型者预后较好，本病 较 B-PLL 恶性度高。NK细胞白血病：NK系列白血病最早描述的是大颗粒淋巴细胞白血病（LGL） , LGL有两种类型：T-LGL 和 NK-LGL，T-LGL 表达 CD3、CD8、CD2、CD16、CD11b、CD57、而 CD56、CD5、CD7、CD4 和 CD25多阴性，有TCR基因重排。NK-LGL表达CD2、CD16和CD56，而CD3、CD4多阴性，CD8、和 CD57弱表达或阴性，无TCRa-0基因重排。最近NK系列白血病又有新的亚型发现，如急性前髓系/NK细 胞白血病、急性髓系/NK细胞白血病、原始NK细胞白血病、NK样T细胞白血病。急性前髓系/NK细胞白 血病是一种最近认识的不同类型的白血病 ,其特点是有明显髓外涉及 ,不成熟的原始淋巴细胞样形态 ,伴 MPO-、CD7+、CD33+/CD13+、sCD3-、cCD3-、CD56+,预后不良。急性髓系/NK细胞白血病，形态学 和免疫表型类似于M3,但无RARa基因重排，一般HLA-DR-、CD33+、CD13+、CD56+，多见于老年病 人，对维甲酸无反应。原始NK细胞白血病，无髓系和淋巴系抗原，CD56+、cCD3+/-、CD2+/-、CD4+/-、 CD7+/-，少数有TCR0基因重排，而无TCRy-6基因重排。NK细胞系列白血病的新亚型是近10年才较多 注意到的白血病,其临床特点,免疫表型,染色体及基因改变需进一步积累病例研究才能彻底明了。大约 10%-20%左右的急性白血病表达CD56,除了原始NK细胞白血病、NK样T细胞白血病、急性髓系/NK细 胞白血病、急性前髓系/NK细胞白血病外，大部分表达CD56的急性白血病是FAB分类的M2、M3、M4、 M5型，这类病人究竟是急性髓系/NK细胞白血病还是急性髓系细胞白血病伴NK抗原表达有待进一步研究， 鉴于急性白血病部分丧失了系列专一性和分化的严格性，可能称为急性髓系细胞白血病伴NK细胞抗原表 达较为合适。成人T淋巴细胞白血病(ATL)：大多数ATL细胞表达激活T细胞表型：CD3、CD4、CD5、CD25、HLA-DR、TCR，一般CD7-和 CD8-，常有粘附分子L-选择素的异常表达；伴有p53异常者预后不良。T-CLL： T-CLL少于CLL总数的1%,细胞形态学类似与一般CLL，但临床发展较快，但多数病人表达CD2、 CD3、CD5、CD7、CD4、少数病人表达 CD8。十三.流式细胞术在血液学中的应用 淋巴瘤免疫分型目前淋巴瘤的分类方法已从LSG的形态学分类逐渐转变为REAL分类法，REAL分类法是以肿瘤发 生源为基础的分类方法,在原来的形态学基础上加上免疫学分型后再加以分类,这种分类方法不仅能够推断 肿瘤的发生源,对治疗也有指导意义。因此淋巴瘤的免疫分型越来越重要。如同白血病免疫分型一样，淋巴 瘤的免疫分型也是利用单克隆抗体检测淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原 ,分析其表现型,以了解被测淋巴 瘤细胞所属细胞系列及其分化程度。流式细胞仪能对多数的淋巴瘤细胞的细胞膜和细胞浆抗原迅速客观地 做出检测，在淋巴瘤的免疫分型中起着不可替代的作用。 临床淋巴瘤的免疫分型的检测标本一般是淋巴结、脾脏、胸水、腹水等。在临床淋巴瘤的免疫分型工作中 常可遇到以下四种情况：B细胞系淋巴瘤T/NK细胞系淋巴瘤淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤造血 细胞以外的肿瘤。REAL 分类淋巴瘤的免疫表型见表 12.8。*：弱表达或阴性。BLBL :前B原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病；BSLL: B-小淋巴细胞淋巴瘤；LPL:淋巴浆细胞样淋巴瘤；MCL:斗 篷细胞淋巴瘤；FCL:滤泡中心淋巴瘤；MZL:边缘带B细胞淋巴瘤；SMZL :脾 MZL ;HCL:毛细胞白血病；PC: 浆细胞瘤；DLBL: B-弥漫性大细胞淋巴瘤；BL: Burkitts淋巴瘤；HBLB:高度B细胞淋巴瘤，Burkitts 样;TLB L:前T原始淋巴细胞淋巴瘤/白血病；TPLL: T幼淋细胞白血病；LGLT大颗粒淋巴细胞白血病，T细 胞型；LGLNK:大颗粒淋巴细胞白血病，NK细胞型；MF:覃样真菌病；PTL:外周T细胞淋巴瘤,非特异;AILD: 血管免疫T细胞淋巴瘤;ACL:血管中心性淋巴瘤；ITCL:肠T细胞淋巴瘤；ATL:成人T细胞淋巴瘤/白血 病；LCL:大细胞淋巴瘤；LCLH:大细胞淋巴瘤，何杰金氏样；1. B细胞系淋巴瘤 大多数情况下，B细胞系淋巴瘤CD19、CD20阳性，分化早期CD20阴性，CD10、 CD34阳性；分化晚期CD5、CD23阳性，成熟为浆细胞后以上标记均阴性。利用单克隆抗体K、入(正常 时K：入=2： 1)可检测免疫球蛋白轻链的偏移，推断是否克隆性增殖免疫球蛋白。表126列出了外周B淋 巴系淋巴瘤的4种类型的免疫分型。SLL(small cell lymphocyte lymphoma)-小细胞淋巴细胞淋巴瘤 : 小细胞淋巴细胞淋巴瘤细胞一般表达CD19、CD20、CD43和CD79, CD5与以上抗原复合表达，slgM、slgD、CD11c和CD25也常表达但表 达较弱，CD10、CD22阴性。伴染色体异常者预后较差。MCL (mantle cell lymphoma)-斗篷细胞淋巴瘤：MCL包括以前分类为中等淋巴细胞淋巴瘤(ILL)、中 度分化淋巴细胞淋巴瘤(IDL)、中心细胞淋巴瘤和套区细胞淋巴瘤(MZL)，占淋巴瘤的2%-8%,入型较k 型常见，sIgM中度表达,lgD弱或阴性，表达CD19、CD20、CD22、CD43，但多数病例CD5阳性CD23 阴性，CD10 一般阴性，CD5阳性CD23阴性和Ig类型可帮助鉴别MCL和FCL。FCL(Follicular center cell lymphoma)-泸泡中心细胞淋巴瘤：FCL 占淋巴瘤的 45%，表达 CD19、CD20、 CD22，sIg强表达，但多数病例CD10和CD23阳性，典型FCCL CD5、CD43和CD11c阴性。CD10阳 性、CD11c阴性和sIg强表达利于与MZL鉴别。MZL(Marginal zone lymphoma) -边缘带淋巴瘤和相关 B 细胞淋巴瘤：典型免疫表型: CD19、 CD20、 CD22、HLA-DR阳性，sIg中度表达，CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性, 多数表达CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25阴性，CD21、CD24多数情况下阴性，利于与CLL/SLL、 FCCL、 MZL 鉴别。2. T/NK细胞系淋巴瘤 早期T细胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3阳性。T/NK细胞系淋巴瘤的详细分 类及表型参见表12.8。细胞膜CD3阳性可确认为外周T细胞肿瘤，外周T细胞肿瘤的特征是CD3与CD4 或CD8复合表达，并常有克隆性T细胞受体，或a-0型或y-6型；MF (mycosis fungoides)-蕈样真菌病和sezary综合症:占皮肤淋巴瘤的绝大多数，CD4阳性，同时表达 CD2、CD3、CD5,有时CD7阴性，CD8阳性病例极少见但已有报道，有无TCR0基因重排对鉴别淋巴 瘤和炎性反应有帮助。LCL（large cell lymphoma）-大细胞淋巴瘤：大细胞淋巴瘤（LCL）占成人淋巴瘤的40%，儿童的1/3, 成人80%是B细胞型的，儿童B细胞型和T细胞型各占一半。3. 淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤 急性髓系细胞白血病（特别是M4、M5）淋巴结转移时有发生，如T、 B 淋巴细胞标记低表达应怀疑并按白血病免疫分型处理。4. 造血细胞以外的肿瘤检测淋巴结、胸腹水标本时如遇CD45阴性情况应考虑非造血系统肿瘤淋巴结、 胸膜、腹膜转移。十四. 流式细胞术在血液学中的应用 红细胞疾病诊断（一）网织红细胞测定计数外周血中网织红细胞数量，对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要 意义。有核红细胞在成熟过程中，脱去细胞核后仍有少量RNA残留在细胞浆内，再经过约一天时间残留RNA 完全消失，成为成熟红细胞。这种细胞浆内有残留RNA的红细胞称作网织红细胞。正常情况下有一定量的 网织红细胞出现在外周血中，正常值为1.01.5%,上限3.0%,但当红细胞数异常时会出现错误结果。因此用 网织红细胞绝对值表示,正常值515J010/L。由于常规方法测定须先在体外经活体染色（最常用亚甲兰）， 然后在显微镜下计数，计数细胞数有限。用流式细胞仪测定网织红细胞具有以下优点:可避免由于细胞核的 碎片或铁幼粒细胞的颗粒的存在而出现假性网织红细胞升高可避免人为误差因为可在短时间内测量上 万个细胞，结果较常规方法准确、可靠，同时可给出网织红细胞年龄结构。流式细胞仪测定网织红细胞方法简单，只须将红细胞洗净后用荧光染料染色后即可上机检测。常用的荧光 染料有焦宁 Y（Pyronin Y） 丫啶橙（Acridine OrangeAO） 碘化丙啶（崐 Propidium Iodine PI）花青 （Cyanine dye）等。（二）PNH 诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）因血细胞膜上锚固蛋白-糖磷酸肌醇（GPI）减少或缺乏而导致与GPI 有关的补体激活抑制因子如CD55、CD59减少或缺乏，因而红细胞对补体异常敏感发生溶血。流式细胞仪 检查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59双阳性细胞95%，PNH病人CD55、CD59明显减 少，这种减少不仅表现在红细胞上，粒细胞、淋巴细胞也有减少。已发现CD55c可能对GPI减少或缺乏 较 CD59 更敏感。十五. 流式细胞术在血液学中应用 血小板功能分析和血小板病诊断一） 血小板功能分析血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期血小板的膜糖蛋白 受体的种类、含量、结构和功能显著不同，用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态。 血小板质膜糖蛋白单克隆抗体 CD41（GPIIb川la）、CD61（GPIIb川la）、CD42b （GPIb）、CD41b （GPIIb）、血 小板颗粒膜糖蛋白 CD62p、 CD63 的测定可供分析血小板功能状态，如 CD62p、 CD63 正常血小板不表达， 当血小板活化时表达明显增加，可用来测定活化血小板。（二）血小板病诊断攪1 血小板相关抗体测定 血小板相关抗体可因不同机制产生。抗血小板自身抗体（包括原发性、药物诱导 产生、合并其它自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮）能引起严重的血小板减少。大多数原发性（免疫性）血小 板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小 板相关抗体的抗原仍不十分清楚，可能有多种，如GPIb、GPIIb、GPIIIa、Pa、或HLA抗原。抗血小 板自身抗体也可能发生于多次输血后或怀孕期间，这些自身抗体多为针对HLA-I类抗原决定簇的抗体， 一般是IgG它们可迅速破坏和清除随机供血者的血小板。因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必 需的。许多不同的利用放免、荧光、酶、SPA等的测定血小板抗体的方法已建立，但这些方法都很复杂、 费时;同时给出的结果只能以一定量的血小板（105）中有多少抗血小板抗体来表示。近年来发展起来的用 FCM 测定血小板抗体的方法具有快速、简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中 FCM 分 析每一个血小板表面有无抗体,能给出血小板群体中有多少血小板表面有抗体（以%表示）; 同时能给出血小 板相关抗体量与血小板数的直方图, 使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况。FCM测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GP I b、IIb、IIb/IIIa的 抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常O型血小板作用后用FCM测定，前者测定 的是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体。2. 血小板无力症 血小板无力症时血小板膜GPIIb/IIIa明显减少，用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41、 CD61和流式细胞仪测定不仅可测出GPIIb/IIIa减少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，还可测出GPIIb/IIIa 减少程度，分类血小板无力症。3. 巨大血小板综合征（BSS）:血小板巨大,CD42a减少，CD42b减少，CD61增加。十六.流式细胞术在血液学中的应用微小残留白血病检测微小残留白血病（Minimal Residual Leukemia MRL）是指白血病经治疗后获得完全缓解（Complete Remisson CR） 后体内残留少量白血病细胞的状态。微小残留白血病与明显白血病（Overt leukemia）无明确界限，仅是白血病细胞负荷数量不同，一般成人明显白血病时白血病细胞可达1012, 经治疗获CR后1010,因此MRL状态白血病细胞数可能是100-10攪。MRL是白血病复发的根源，因此 检测MRL有十分重要的意义：指导临床治疗预测白血病复发评价自体骨髓移植的净化效果。应用 FCM检测MRL的优点在于可在短时间内分析大量标本，具有快速的特点。由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM检测MRL的效果尚不理想，敏感性尚不够高，一般仅有1/103-104。 目前主要有两类检测方法:用FCM分析CR期骨髓细胞核酸量或染色体，可用于部分AL病人MRL分析, 但敏感性仅1-5%。免疫表型分析，由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量的差 别及分布部位的不同作为检测依据;如利用TdT和CD10双标记检测MRL,但敏感性亦不高，约0.1-1%。 假阴性结果可能由于：标本中的白血病细胞10-4攪或10-5;所取标本不能代表全身骨髓情况;病 人白血病细胞表型转换。十七. 流式细胞术在血液学中的应用白细胞吞噬功能测定粒、单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员。它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来 的微生物、肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取、修 饰、递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的。因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要 意义。以下简要介绍FCM测定白细胞吞噬功能的概况。应用光学显微镜、荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒、单核细胞, 并尽可能地保持细胞活性。用FCM检测时不须分离细胞，应用全血即可，因此可在自然状态下测定，结果准确可靠。目标粒子一般以酵母、细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常 用者为FITC（异硫氰酸荧光素）或RA（罗达明）.以肝素或拘橼酸抗凝取外周血（避免用EDTA）,200pl全血与目标粒子200pl（目标粒子浓度4x107/ml）置 379温育,温育结束后立即置冰水中，以同样标本不在379 温育而置于冰水中者作为对照。目标粒子不同 温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌25分钟,FITC标记的粒子15分钟即可达到吞噬饱和;此外， 粒子与白细胞的比例也很重要,一般为 10:1。温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测。应用FCM全血法测定白细胞吞噬功能，对白细胞的丢失、损伤最小；此外用本法可测定血清中的调理 素（Opsonine）水平及血清中有无吞噬作用抑制因子。如果用FITC标记的 单克隆抗体CD13、CD14、CD15 标记粒、单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作 进一步的研究。十八流式细胞术在血液学中的应用NK和LAK细胞活性测定NK 细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无 MHC 限制性,它 们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人 NK 细胞一般表达 CD56、CD16、CD57 部分表达 CD2、CD8、CD11 而不表达 CD3。LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中，LAK前体细胞表达NK 细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3、CD4、CD5等；它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能 杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞，但严格讲LAK细胞对K562 细胞的杀伤活性不能称作LAK活性，测定LAK活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞，如HL-60细胞、 HeLa细胞等。常用的测定NK和LAK细胞活性的方法较多，如攩51Cr释放法、3H TdR参入法或释放法、LDH 释放法、ATP发光法等;应用放射性同位素对人体和环境不利，利用FCM测定NK和LAK细胞活性从1986 年就开始摸索，方法已趋于成熟，以下介绍其中一种:肝素抗凝取外周血后分离PBMC后洗净，调整细胞浓度为106/ml，为效应细胞；靶细胞分别为K562和 HL-60 或 HeLa 细 胞 ， 在 对 数 生 长 期 受 集 细 胞 ， 调 整 浓 度 为 106 。 用 3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)标记靶细胞，效应细胞:靶细胞(E:T)为 40:1、20:1、 10:1和5:1,孵育后加入PI(10ug/m染死细胞，洗净后即可上机检测。DiO发绿荧光,PI发红荧光，利用双参数 (FLWFL2)直方图可清楚地了解靶细胞中的死亡细胞，计算出靶细胞溶解率。十九流式细胞术在血液学中的应用造血干/祖细胞测定造血干/祖细胞移植已广泛应用于血液肿瘤、实体瘤、某些遗传性疾病、免疫缺陷病等，因此检测造 血干/祖细胞已成为临床必不可少的手段。应用流式细胞仪多色技术测定外周血造血干/祖细胞，具有快速、 准确的优点，不仅能确定造血细胞数量，而