CpGODN的免疫刺激作用

陈军浩南京大学医学院附属鼓楼医院CPG概念概念n为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列，即复序列，即CpG CpG 基序。基序。n一种免疫佐剂一种免疫佐剂n作用靶点作用靶点TLR9TLR9n细胞免疫，体液免疫细胞免疫，体液免疫Th1免疫应答免疫应答n慢性乙型肝炎患者细胞免疫低下慢性乙型肝炎患者细胞免疫低下nHBVHBV免疫耐受，持续感染免疫耐受，持续感染n肿瘤微小残留病的清除肿瘤微小残留病的清除CPG提高提高PBMC中中Th1细胞细胞Th1Th1占淋巴细胞百分比占淋巴细胞百分比CPG提高提高PBMC中中Th1、Tc1细胞百分率细胞百分率*：与对照组比较，CPG刺激刺激BPMC分泌细胞因子分泌细胞因子*：与对照组比较，CPG诱导诱导PBMC杀伤靶细胞杀伤靶细胞n收集收集CPG活化的活化的PBMCn细胞毒性实验：效应细胞为细胞毒性实验：效应细胞为CPG活化的活化的PBMC；靶细胞为；靶细胞为CFSE预染的预染的K562细胞。细胞。对照组效应细胞为未经对照组效应细胞为未经CPG活化的活化的PBMC。n效：靶效：靶20：1，混合培养，混合培养2h。流式细胞术。流式细胞术检测靶细胞死亡率。检测靶细胞死亡率。CPG诱导诱导PBMC杀伤靶细胞杀伤靶细胞CFSE染色靶细胞染色靶细胞n浓度为浓度为5mol/L 的的CFSE（2羧基荧羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）工作液光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）工作液n取对数生长期的靶细胞浓度取对数生长期的靶细胞浓度108/Ln细胞悬液与等体积细胞悬液与等体积CFSE 工作液混合工作液混合n37 孵育孵育10 min。n离心洗涤两次后离心洗涤两次后n悬浮细胞备用悬浮细胞备用CFSE染色靶细胞染色靶细胞实验结果实验结果 CpG活化活化PBMCPBMC对对K562细胞的杀伤作用细胞的杀伤作用(N=5)(N=5)CPG活化PBMC 5.14%对照组2.83%*：与对照组比较，与对照组比较，CIK细胞杀伤靶细胞细胞杀伤靶细胞CIK细胞杀伤靶细胞细胞杀伤靶细胞研究背景研究背景 通过主动免疫、过继特异性免疫、通过主动免疫、过继特异性免疫、过继非特异性免疫等方式，清除慢性乙过继非特异性免疫等方式，清除慢性乙肝患者体内残存的肝患者体内残存的HBV，达到治疗效，达到治疗效果果。研究背景研究背景 B B淋巴细胞具有抗原递呈细胞的性质，淋巴细胞具有抗原递呈细胞的性质，同时具有同时具有CpG-ODNCpG-ODN受体：受体：TLR-9TLR-9。本研究。本研究探讨探讨CpG-ODNCpG-ODN诱导诱导B淋巴细胞成为高效淋巴细胞成为高效APC，使之具有类似于树突状细胞功能，使之具有类似于树突状细胞功能的可行性的可行性。TOLL受体受体TOLL受体在血细胞中的表达受体在血细胞中的表达活化活化B细胞负载核心抗原细胞负载核心抗原n磁珠分选磁珠分选B淋巴细胞淋巴细胞nCPG活化活化B淋巴细胞淋巴细胞n核心抗原肽核心抗原肽:FLPSDFFPSV-FITCn流式细胞仪、荧光显微镜检测抗原负载流式细胞仪、荧光显微镜检测抗原负载状况状况磁珠分选磁珠分选B细胞细胞分选前分选前B B细胞细胞 7.89%7.89%分选后分选后B B细胞细胞 89.6%89.6%活化活化B细胞负载抗原肽细胞负载抗原肽Marker%GatedAll100.00M141.34M1活化活化B细胞负载核心抗原细胞负载核心抗原荧光显微镜观察荧光显微镜观察B细胞负载细胞负载HBcAg18-27肽肽 APC与与T细胞作用机制细胞作用机制CPG对对B细胞抗原递呈相关分子的细胞抗原递呈相关分子的作用研究作用研究nCpG2006、2216由上海生物工程技由上海生物工程技术服务有限公司合成，全硫代化修饰术服务有限公司合成，全硫代化修饰n对照组为含对照组为含10%FCS的的RPMI1640外周血外周血PBMC，细胞量，细胞量107/孔，孔，37、5%CO2、48小时小时n实验组加入实验组加入CpG2006或或CpG2216，终浓度均为终浓度均为1umol/mL，余同上，余同上CpG提高淋巴细胞提高淋巴细胞CD69表达表达 T T淋巴细胞淋巴细胞 B B淋巴细胞淋巴细胞 CD69表达率（%）*：与对照组比较，B细胞细胞CD80、CD86表达表达对照组对照组加加CPG-ODN组组加加CPG-ODN组组CpG提高提高B细胞表面细胞表面CD80、CD86的表达的表达 CD80 CD80 CD86CD86CD80、CD86表达率（%）*：与对照组比较，B细胞细胞MHC-、MHC-表达表达对照组对照组加加CPG-ODN组组CpG提高提高B细胞表面细胞表面MHC-、MHC-的表达的表达 MHC-MHC-MHC表达量（MFI）*：与对照组比较，与对照组比较，活化活化B细胞诱导细胞诱导CTLn负载了抗原的活化负载了抗原的活化B细胞与淋巴细胞混合培细胞与淋巴细胞混合培养养(含含IL-2的的RPMI1640培养液培养液).n收集细胞收集细胞,以五聚体技术检测以五聚体技术检测HBV特异性特异性CTL.n实验组特异性实验组特异性CTL为为0.500.19%，对照组，对照组为为0.200.10%。特异性特异性CTL诱导诱导Pro5TM MHC Pentamers检测对照组和实验组检测对照组和实验组HBcAg18-27抗原特异抗原特异性性CTL（Q2-1区）。前者为对照组（未加区）。前者为对照组（未加APC），后者为实验组（加），后者为实验组（加APC）。）。结论结论nCpG能够活化能够活化B细胞，对细胞，对T细胞无明显的作用细胞无明显的作用nCpG能够提高能够提高B细胞表面抗原递呈相关分子的表达细胞表面抗原递呈相关分子的表达nCPG诱导诱导PBMC产生高水平的产生高水平的IFN-nCPG诱导淋巴细胞向诱导淋巴细胞向Th1、Tc1分化分化nCPG增强增强PBMC对对K562细胞的杀伤作用细胞的杀伤作用n通过通过B细胞介导细胞介导,CPG可诱导特异性可诱导特异性CTL