荧光原位杂交fish

2.9 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）非同位素原位杂交技术可用于测定细胞或组织中特异性转录物定位及其表 达的相对水平。它是用一标记生物素或地高辛的非放射性探针和所制备样本的 RNA进行杂交，非同位素探针通常通过荧光或酶法予以检测。FISH试验用水须 以DEPC处理，所用溶液的配置均使用DEPC处理过的水，以抑制RNA酶活性。 (1) 杂交探针的制备实验中针对AOB、NOB和Anammox bacteria的寡核苷酸探针如表2-9所示，合 成。全菌数的检测采用DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)染色，呈蓝色，双重染 色后可以在显微镜的同一视野下观察可以检出细菌的丰度。探针由Invitrogen生 物科技有限公司合成。表2-9 FIS H中所使用的寡核苷酸探针Tab.2-9 Oligonucleotide probes used for FISH in this study名称染料甲酰胺(%)核苷酸序列(5-3)目标菌PLA46Cy5 （红）30GAC TTG CAT GCC TAA TCCPlanctomycetalesAnaerobicammonium-oxidizing bacteriaAmx820Cy5 （红）40AAA ACC CCT CTA CTT AGTGCC CCandidatus“Brocardia anammoxidans” andCandidatus “ Kueneniastuttgartiensis”NSO190FITC（绿）55CGA TCC CCT GCT TTT CTC CBetaproteobacterial ammonia-oxidizing bacteriaMost of the halophilicNEU653FITC（绿）40CCC CTC TGC TGC ACT CTAand halotolerantNitrosomonas spp.Nit3Cy3(蓝)40CCT GTG CTC CAT GCT CCGNitrobacter spp.Ntspa712Cy3(蓝)50CGC CTT CGC CAC CGG CCTTCCMost members of the phylum NitrospiraeEUB338FITC（绿）20GCT GCC TCC CGT AGG AGTMany but not allbacteriaTo be used inEUB338IIFITC（绿）20GCA GCC ACC CGT AGG TGTcombination with probeEUB338To be used inEUB338IIIFITC（绿）20GCT GCC ACC CGT AGG TGTcombination with probeEUB338参考文献(2) 药品与试剂1) 4%多聚甲醛固定液加入略少于2/3最终体积的水，加热至60C。称出制备4%溶液的多聚甲醛 的量，并一边搅拌一边加入水中，加盖放入通风橱内，保持60C并搅拌，用巴斯 德吸管加入一滴2M NaOH,使溶液澄清，停止加热并加入1/3体积的3xPBS, 用 HCl 调 pH 值至 7.2，加水至最终体积，使用 Millipore 滤膜过滤。冷却至室温， 现用现配。2) lx明胶浸泡溶液，4C。在70C水中溶解明胶配置成0.5%(m/V)的溶液，冷却至室温，加入硫酸钾铬 至0.05%，于冰水浴冷却至4C，立即使用。3) 杂交缓冲液5M NaCl, 10%SDS，1M Tris-HCl,甲酰胺浓度视探针类别确定。4) 杂交清洗液5M NaCl，10%SDS，1M Tris-HCl，甲酰胺浓度视探针类别确定。(4) 生物膜/活性污泥的预处理1) 提取1ml生物膜/活性污泥于1.5ml离心管内，超声处理1min，10000g下 离心 5min；2) 弃去700ul上清液，加入900ul的4%多聚甲醛，涡旋30s以混合样品，4C 下静置 2h；3) 10000g下离心5min，弃去上清液，加入1ml1xPBS缓冲液；4) 10000g下离心5min，弃去上清液，加入500ul1xPBS缓冲液和500ul99.5% 乙醇，-20C下保存。(5) 明胶包被载玻片1) 将载玻片在10%KOH溶液中浸泡1h，取出后用灭菌水冲洗干净，晾干；2) 将载玻片在70C明胶溶液中浸渍几下，空气中晾干，4C下保存。(6) 荧光原位杂交1) 混合预处理的生物膜/活性污泥样品，吸取 5ul 样品涂于明胶包被的载玻 片上，空气中晾干；2) 依次在50%、80%、99.5%的乙醇中各浸渍3min，取出后空气中晾干；3) 取 9ul 杂交缓冲液和 1ul 探针轻轻混合后，滴加到固定样品的载玻片上， 水平放置玻片于杂交湿盒中，40C下杂交3h；4) 取50ml杂交清洗液于48C水浴中预热，将去离子水于4C下保存备用。(7) 未结合探针的清洗及结果观察1) 杂交结束后，用48C预热的杂交清洗液冲洗载玻片，将载玻片放入杂交 清洗液中 20min；2) 取出载玻片用4C去离子水清洗载玻片，空气中晾干，滴加数滴防荧光褪 色液，盖上盖玻片，用指甲油对周边密封，放入玻片盒中避光待观察；3) 用激光共聚焦扫描显微镜检测杂交信号，并用图像软件分析图像