免疫组化-非标记免疫酶法(PAP)

非标记抗体酶法由于酶标抗体存在一些缺点，例如酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法）。现分述如下。（一）酶桥法1基本原理首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节省第一抗体的用量。2染色步骤 主要程序如图4-4图4-4酶桥法主要染色步骤（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属A）孵育24h（4）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属a IgG抗体）孵育11.5h（室温）。应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。（3）切片与抗酶抗体（来自种属A）孵育11.5h（室温）。因抗酶抗体和第一抗体均系种属a IgG，具有相同的抗原性 ，所以 桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。（4）切片与酶（HRp 70100g/ml,PBS溶解）孵育0.5h（室温），酶与抗酶抗体结合。（5）显色等与酶标抗体法相同。酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，现为ICC研究中常用的方法之一。（二）PAP法1PAP的制备及特征 PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。（1）制备抗HRP血清：健康雄性家兔（2.0kg以上），可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗（共10mg），2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0ml乳剂（福氏完全佐剂，含HRP3.3mg(RZ=3.0);间隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg；再间隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP0.1mg/ml）为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。（2）制备PAP复合物：离体条件下，使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高（RZ3），而制备PAP复合物时，HRP的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。【步骤】取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP（1.0mg/ml）的水溶液。混匀，室温1h后，离心16000g 415min。0.9% NaCl(冷盐水)溶解沉淀，离心16000g 415min，重复4次。加15.3ml HRP水溶液（含HRP30.64mg），室温，持续搅拌。用1N HCl及0.1N HCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1N 及0.1n NaOH调pH至7.2。慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置045min。离心35000g 015min，沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。用10.50ml水溶解沉淀，对透析液（48.6g NaCl, 1.5N NaOOCCH3 30ml, 3N(NH4)2SO430ml, 水5.94L）透析，4离心，收集上清，加透析液使体积至10.50ml，分装低温保存。PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。采用H2O2-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm 。这种结构异常稳定。据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。2PAP染色原理及步骤（1）原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用PAP复合物代替，即第三步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。医学全在线（2）染色步骤：主要步骤与酶桥法相似，如图4-5。切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法；切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。图4-5PAP法主要染色步骤用离体制得的PAP复合物（1：30300稀释）孵育11.5h（室温），使其被桥抗体连结在第一抗体上。亦可用ALP抗ALP复合物代替。显色观察等同间接法。3PAP法的评价PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。其主要特征和注意事项如下：（1）抗体活性高：非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程（共价键连结）对抗体活性的损害。（2）灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。从理论上讲，PAP法应该较间接法敏感2倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1：1标记，而PAP复合物含有3个HRP分子。假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以PAP法应较敏感。我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度；但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N）表示。据此，Sternberger(1979)认为PAP法较间接法敏感2025倍，可进一步稀释第一抗体，以节省其用量。但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。笔者在实验中注意到，PAP显示阳性的抗原，相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而时间阴性时，PAP法亦为阴性。其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”（游离）的Fab段少，PAP复合物被连结的相应减少有关。另外 ，PAP复合物分子量较大（400KD）,冰冻切片时，对组织穿透性远不如酶标抗体（分子量90180kDa），所以不适于免疫电镜的标本制作。