菌落总数与大肠菌群数测定.ppt

菌落总数与大肠菌群数测定 主要内容 菌落总数测定 大肠菌群测定 MPN法原理（拓展内容） 菌落总数测定 掌握菌落总数测定方法 实验原理 不同稀释度的样品，营养琼脂培养基， 36 ， 48h（水产品 30 ， 72h ），菌 落数 菌落总数测定 器材与试剂： 样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基， 1ml吸管，培养皿 菌落总数测定 倾注培养 培养结果 菌落总数测定 实验步骤 5.菌落计数： 肉眼观察，可用放大镜，可标记 必要时分区计数，菌落成片者作废 计算方法 某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值 选择菌落数在 30-300之间的稀释度 （ 1）仅有一个稀释度在此范围： 菌落数 稀释倍数 菌落总数测定 计算方法： （ 2）有两个稀释度在 30-300之间 菌落数之比 2，选较小值 菌落数之比 300 取稀释倍数最大者 （ 4）所有稀释度均 30 取稀释倍数最小者 （ 5）没有任何稀释度在 30-300之间 选最接近该范围者 结果单位： CFU/ml（ g） 菌落总数测定 注意事项： 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识 大肠菌群数测定 实验目的 实验原理 36 ， 48h，产气（小倒管） 三步法：初发酵、复发酵 器材与试剂 样品、无菌生理盐水、 LST肉汤， BGLB肉汤 1ml吸管、 10ml吸管、试管、小倒管 初发酵 器材与试剂 样品、 225ml无菌生理盐水、 9ml无菌生理盐水、双料 LST 肉汤，单料 LST肉汤， 10ml吸管、 1ml吸管、吸球 大肠菌群数测定 实验步骤： 1.初发酵 吸取样品方法 加注样品 初发酵结果 右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。 实验步骤 3.复发酵 （ 1）选取产气试管 （ 2）接种至 10mlBGLB肉汤中 （ 3）培养： 36 ， 48h （ 4）观察指标：若产气则报告大肠菌 群阳性。 大肠菌群数测定 实验步骤 2.分离培养 （ 1）制备伊红美蓝平板： 45 ，无菌，倾注， 15ml （ 2）选产酸产气的发酵管 （ 3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （ 4）培养： 36 ， 48h 分离培养 器材与试剂 初发酵结果（ 4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰 平板培养基 分区划线法 第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环 分区划线法 操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈 30-40 角 3.每次划线应该压到上一个区域的 2-3条线 4.用接种环的 “ 面 ” 而不是 “ 弧 ” 在平板上 滑动 大肠菌群数测定 实验步骤 2.分离培养： （ 5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深 （ 6）革兰染色、镜检：选特征菌落 革兰染色法 器材与试剂 结晶紫、卢戈碘液、 95%乙醇、酸性复红、生理 盐水、酒精灯、载玻片、滤纸 革兰染色法 涂片：接种环，挑取菌落， 生理盐水一滴，涂匀 热固定：通过火焰若干次 初染：结晶紫一滴， 1min，水洗 媒染：卢戈碘液一滴， 1min，水洗 脱色： 95%乙醇， 30s或至无色为止 复染：复红一滴， 30s 涂片 热固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏染色阴性 革兰氏染色阳性 革兰染色法 复发酵 器材与试剂 培养 24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、 复发酵管 大肠菌群数测定 实验步骤 3.复发酵 （ 1）选取鉴定为无芽孢 G-杆菌的菌落 1-3个 （ 2）接种至 10ml乳糖蛋白胨培养液 （ 3）培养： 37 ， 24h （ 4）观察指标：产酸，产气 液体接种 复发酵 复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有 气体产生 大肠菌群数测定 注意事项： 1.无菌操作 2.吸管使用 3.洗去染液的方法 4.显微镜保养 5.液体接种 MPN法原理 MPN法（ Most Probable Number Method） 目的：对某种细菌进行选择性计数 核心思想：泊松分布 实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分 别接种若干培养管，根据阳性管数估算 MPN值 MPN法原理 MPN法（ Most Probable Number Method） 1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布 : P(x=k)=e-x xk/k! x:细菌浓度， k:进入发酵管的细菌数 2.若在 n管发酵中，令接种水样量为 Vi，阳性管数为 Pi，阴性管数为 Qi，则该检验结果发生的概率为： 其中 C为常系数 V为总水样量， x为细菌个数 / 1 ( ) ( 1 ) ( ) ii n V x V V x V P i Q i i y x C e e 1 ( ) ! / ( ! ! )n i C P i Q i P i Q i MPN法原理 3.当 y(x)max， XMPN 4.由于 y(x)为单极值函数，令 dy/dx=0,即 5.解此方程，得 x=MPN 6.该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解 7.日常实验时采用查表法推算 MPN值。 8.表格在教材第 260-261页。 / 1 ( ) 0 1 n V ix V i PiV i Q i e